發(fā)布時(shí)間：2017-04-03 02:01

  本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲吡喹酮抗性蟲株免疫學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲又稱裂體吸蟲（Schistosoma）是一類寄生于人體及哺乳動(dòng)物靜脈血管內(nèi)的寄生蟲，引起以免疫病理損傷為主、嚴(yán)重危害流行區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民身體健康的人畜共患病-血吸蟲�。⊿chistosomiasis）。該疾病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，有78個(gè)國家和地區(qū)流行血吸蟲病，其中有52個(gè)國家屬于高危流行區(qū)。據(jù)WHO報(bào)告，2012年全球有約7億人受血吸蟲病威脅，約2.5億血吸蟲病病人，每年至少還有20萬人死于血吸蟲病。我國流行日本血吸蟲病，目前主要流行于長江中下游地區(qū)，是我國主要寄生蟲病之一。經(jīng)過50多年血吸蟲病防治工作，我國的血吸蟲病流行得到有效的控制，目前，上海、浙江、福建、廣東和廣西5省市區(qū)已達(dá)到傳播阻斷標(biāo)準(zhǔn)，四川、云南和江蘇3省達(dá)到傳播控制水平。但截至2012年底，全國仍有病人約24萬，有螺面積36.9萬公頃，且每年都有新發(fā)釘螺地區(qū)，嚴(yán)重危害流行區(qū)居民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。因此，現(xiàn)階段血吸蟲病仍是我國重要的公共衛(wèi)生問題。 吡喹酮是20世紀(jì)70年代研制的抗絳蟲藥，隨后發(fā)現(xiàn)其對(duì)人體5種主要血吸蟲均有殺滅作用，同時(shí)由于吡喹酮在治療血吸蟲病中具備高效低毒，服用方便等特點(diǎn)，使其隨即取代其他抗蟲藥物，被WHO推薦為治療血吸蟲的首選口服藥物。吡喹酮口服后在消化道內(nèi)吸收良好，吸收部位主要在小腸，給藥5min即可測(cè)得原藥，1-1.5h血藥濃度達(dá)峰值，原藥半衰期為1-1.5h，大部分由腎臟排泄。雖然對(duì)吡喹酮?dú)缪x作用機(jī)制已有大量研究，但至今仍沒有完全闡明，目前對(duì)其認(rèn)知大致可概括為方面，一是對(duì)蟲體的直接作用，包括對(duì)蟲體活動(dòng)的影響、皮層的損害和代謝的影響；二是對(duì)宿主免疫效應(yīng)的依賴性及其協(xié)同作用。 全世界每年約有2.5億血吸蟲病人需要吡喹酮的治療，在高危流行區(qū)采用吡喹酮周期的、大范圍人群化療是目前全球血吸蟲病控制的主要策略，但已有研究報(bào)道對(duì)同一人群采用吡喹酮反復(fù)進(jìn)行抗蟲治療，有導(dǎo)致血吸蟲對(duì)吡喹酮產(chǎn)生抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。1994年，，Doenhoff等首次在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用亞治療劑量吡喹酮誘導(dǎo)篩選出曼氏血吸蟲吡喹酮抗性株，同時(shí)，在曼氏血吸蟲病流行的非洲和南美洲現(xiàn)場(chǎng)，也發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲對(duì)吡喹酮的敏感性下降；埃及血吸蟲也出現(xiàn)對(duì)吡喹酮治療不敏感的病例報(bào)告。2011年，梁幼生等在實(shí)驗(yàn)室采用亞治療劑量吡喹酮同樣地誘導(dǎo)出2株日本血吸蟲吡喹酮抗性株。迄今為止吡喹酮是目前現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模使用的唯一抗血吸蟲的治療藥物，由于還沒有可完全替代吡喹酮藥物及有效的疫苗出現(xiàn)，因此開展對(duì)吡喹酮抗性株的相關(guān)研究，了解掌握吡喹酮抗性株生物學(xué)、免疫學(xué)特性，及產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制等，可對(duì)控制吡喹酮抗性的擴(kuò)散提供資料，同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)和分析藥物作用靶點(diǎn)提供新的途徑。 已有研究證實(shí)，曼氏血吸蟲吡喹酮抗性株和敏感株各發(fā)育階段的對(duì)吡喹體外反應(yīng)性均存在顯著差異，體內(nèi)成蟲和蟲卵階段對(duì)吡喹酮的反應(yīng)也存在差異；在基因表達(dá)水平上，抗性株某些蛋白表達(dá)水平要高于敏感株，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞色素-C氧化酶。但目前關(guān)于日本血吸蟲吡喹酮抗性株的研究資料很少，對(duì)日本血吸蟲吡喹酮抗性株的免疫學(xué)特性研究尚未見專門研究，本研究試圖通過對(duì)抗性株和敏感株成蟲和蟲卵的抗原組分，及抗性株和敏感株感染宿主后宿主反應(yīng)性等進(jìn)行研究，旨在了解吡喹酮抗性株免疫學(xué)特性變化及為抗性機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，內(nèi)容主要分以下3方面： 第一部分：日本血吸蟲吡喹酮抗性株及敏感株成蟲和蟲卵抗原組分分析 以定量的日本血吸蟲尾蚴感染小鼠，感染42天后剖殺，抗凝生理鹽水灌注法收集成蟲，并取肝臟組織。肝臟組織用組織勻漿機(jī)打碎，分別通過120目/25.4mm2和160目/25.4mm2不銹鋼網(wǎng)篩分離濃集蟲卵。在玻璃勻漿器中加入適量細(xì)胞裂解液和成蟲或蟲卵研磨裂解，超聲離心后吸取上清，獲相應(yīng)可溶性蛋白。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后用Image Lab凝膠圖像分析軟件進(jìn)行比較，分析抗性株和敏感株抗原組分及分子量；同時(shí)用quantityone分析泳道光密度，比較條帶蛋白濃度。結(jié)果顯示：經(jīng)電泳分離，雌蟲AWA組分可分成21-23條帶，雄蟲AWA組分可分成26-36條帶，SEA組分可分成22-31條帶。雌蟲與雄蟲AWA兩者間有較大的差異，其中在40-50kDa和80kDa兩區(qū)間差別最大；而SEA與AWA亦有較大的差異，尤其是40-50kDa區(qū)間，此外，SEA與雄蟲AWA在80kDa差異較大，但與雌蟲AWA差異不明顯。研究提示：吡喹酮抗性株和敏感株各抗原組分間差異不明顯，但泳道光密度分析顯示，在相同蛋白濃度下，泳道光密度強(qiáng)度存在差異，提示與敏感株相比抗性株存在部分蛋白表達(dá)水平的上調(diào)和下調(diào)，其中以SEA和雌蟲AWA較為明顯。 第二部分吡喹酮對(duì)日本血吸蟲吡喹酮抗性株及敏感株皮層的損傷 小鼠分別感染抗性株和敏感株尾蚴后分為用藥組和不用藥對(duì)照組，用藥組于感染后第35-37天分別灌服75mg/kg、300mg/kg吡喹酮，灌服吡喹酮10min和12h后分別解剖小鼠，采用灌注法收集成蟲，置預(yù)冷4%戊二醛溶液中固定，經(jīng)梯度濃度丙酮脫水、噴金，用掃描電子顯微鏡觀察蟲體皮層超微結(jié)構(gòu)的改變，比較抗性株和敏感株皮層損傷的差異。結(jié)果顯示：對(duì)照雌蟲體表光滑，體表無圓凸，部分體壁可見有呈錐狀的小棘；對(duì)照雄蟲體表體棘呈海綿狀排列，具有明顯而復(fù)雜的褶嵴和凹窩，排列成網(wǎng)格狀，全身布滿隆起的圓凸，其中分布有蒂乳突狀感覺器。75mg/kg PZQ處理后，敏感株雌蟲蟲體體表褶嵴出現(xiàn)局限性水腫，而抗性株則沒有明顯改變；12h后，敏感株體表可見較多完整或破損的泡狀物，而抗性株褶嵴則開始出現(xiàn)少量水腫；300mg/kg PZQ給藥10min后，抗性株和敏感株蟲體肌肉嚴(yán)重收縮，體表紋理開始紊亂不平滑，對(duì)比兩者，敏感株體表收縮程度大于抗性株，同時(shí)抗性株和敏感株體表均出現(xiàn)因小棘凹陷而致的陷窩，給藥12h后，敏感株出現(xiàn)完整或破損的泡狀物，而抗性株僅出現(xiàn)完整的泡狀物。雄蟲在75mg/kg PZQ處理10min后，敏感株蟲體皮層出現(xiàn)空泡和完整或破損的泡狀物，而抗性株蟲體皮層僅出現(xiàn)空泡和少量泡狀物；給藥12h后，敏感株蟲體皮層有廣泛的泡狀物，并伴有破潰、糜爛和剝落，而抗性株蟲體皮層僅在局部出現(xiàn)完整或破損的泡狀物；在300mg/kg PZQ處理10min后，敏感株和抗性株蟲體因收縮致皮層褶皺紋理紊亂，并有陷窩出現(xiàn)，給藥12h后，敏感株蟲體皮層褶皺腫脹、融合，并廣泛糜爛、剝落，已看不清體表褶皺結(jié)構(gòu)；抗性株蟲體雖亦有大量糜爛、剝落，但仍能看清體表褶皺結(jié)構(gòu)。研究提示：吡喹酮對(duì)抗性株和敏感株皮層的損傷不相同，敏感株的損傷比抗性株更嚴(yán)重，提示日本血吸蟲吡喹酮抗性株對(duì)吡喹酮的作用敏感性降低。 第三部分吡喹酮抗性株及敏感株感染及經(jīng)吡喹酮治療后宿主輔助性T細(xì)胞反應(yīng)性 1吡喹酮抗性株及敏感株感染及經(jīng)吡喹酮治療后對(duì)小鼠輔助性T細(xì)胞亞群的影響 以定量日本血吸蟲尾蚴感染小鼠，用藥組小鼠于感染第5周灌服300mg/kg吡喹酮，分別于感染后第2周、第5周、第7周和第9周處死小鼠，無菌取脾臟，制備脾單個(gè)核淋巴細(xì)胞。脾單個(gè)核淋巴細(xì)胞用PMA和離子菌素在37℃下刺激培養(yǎng)6h，采用流式細(xì)胞分析儀分別檢測(cè)Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞占CD3+CD8-細(xì)胞的比例，本實(shí)驗(yàn)以胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來區(qū)分Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，其中以胞內(nèi)染色I(xiàn)FN-γ陽性的細(xì)胞定義為Th1細(xì)胞，以胞內(nèi)染色I(xiàn)L-4陽性的細(xì)胞定義為Th2細(xì)胞。結(jié)果顯示：抗性株和敏感株感染后，Th1細(xì)胞比例在第2周時(shí)所占比例最高，此后降低；Th2細(xì)胞比例在感染后前3階段較低，且變化不明顯，在第9周顯著升高，抗性株和敏感株在感染后各階段Th細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例沒有差異（P0.05）。經(jīng)吡喹酮治療后，江蘇抗性株在第7周用藥組小鼠脾臟Th2細(xì)胞比例高于未用藥組（P0.05）；敏感株在第9周用藥組小鼠脾臟Th2細(xì)胞比例高于未用藥組（P0.05）；而湖南株兩者沒有差異（P0.05）�？剐灾旰兔舾兄瓯容^，在治療后均無明顯差異（P0.05）。研究提示：吡喹酮抗性株和敏感株對(duì)終宿主T細(xì)胞亞群的分化作用無差異；但經(jīng)吡喹酮治療后江蘇株感染終宿主Th2細(xì)胞亞群的分化作用有顯著影響，吡喹酮治療后，Th2細(xì)胞亞群所占百分比明顯下降。2吡喹酮抗性株及敏感株感染及經(jīng)吡喹酮治療后對(duì)小鼠輔助性T細(xì)胞因子的影響 以定量日本血吸蟲尾蚴感染小鼠，在感染第5周后300mg/kg吡喹酮灌服用藥組，分別于感染后第2周、第5周、第7周和第9周眼眶采血，制備血清。采用BD Cytometric Bead Array Mouse Th1/Th2cytokine kit和流式細(xì)胞分析儀測(cè)定Th1類細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、TNF和Th2類細(xì)胞因子IL-4、IL-5的水平。結(jié)果顯示：江蘇抗性株和敏感株感染后，小鼠血清IL-2變化不明顯，于第5、7周達(dá)最高值；血清IFN-γ于感染后在第5周達(dá)高峰，從第7周開始迅速下降；血清TNF持續(xù)升高，在感染后第9周達(dá)到高峰；IL-4和IL-5都是在第5周達(dá)最高峰，其他時(shí)間段沒有明顯變化�？剐灾旰兔舾兄瓯容^，實(shí)驗(yàn)各階段敏感株感染小鼠血清IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5都高于抗性株，而TNF在感染2周后抗性株高于敏感株。經(jīng)分析，江蘇抗性株和敏感株感染小鼠后第5周血清IL-4水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。湖南抗性株和敏感株感染后，小鼠血清IL-2變化不是很明顯，于第5、7周達(dá)最高值；血清IFN-γ于感染后在第5周達(dá)高峰；從第7周開始迅速下降；血清TNF持續(xù)升高，在感染后第9周達(dá)到高峰；IL-4和IL-5都是在第5周達(dá)最高峰，其他時(shí)間段沒有明顯變化�？剐灾旰兔舾兄瓯容^，經(jīng)分析，第5周血清IFN-γ水平不相同（P0.05），抗性株高于敏感株；第7周血清TNF水平存在差異（P0.05），抗性株高于敏感株；第2周IL-5存在差異（P0.05），敏感株要高于抗性株；第5周血清IL-4、IL-5水平存在差異（P0.05），抗性株要高于敏感株。吡喹酮治療后，江蘇抗性株用藥組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平在第7、9周均高于未用藥組，TNF水平低于未用藥組；而敏感株用藥組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平在第7周低于未用藥組，于第9周達(dá)相同水平，TNF水平則始終低于未用藥組。經(jīng)分析，江蘇抗性株用藥組和未用藥組小鼠血清IL-5在第7周、TNF在第9周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；江蘇敏感株用藥組和未用藥組小鼠血清TNF在第7周和第9周差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。湖南株抗性株用藥組IL-2、IL-4、IL-5水平在第7、9周均高于未用藥組， IFN-γ、TNF水平低于未用藥組；而敏感株用藥組IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-5水平在第7、9周均低于未用藥組。經(jīng)分析，湖南抗性株用藥組和未用藥組小鼠血清TNF、IL-5在第7周，IFN-γ、TNF在第9周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；湖南敏感株用藥組和未用藥組小鼠血清IFN-γ、TNF在第7周，IL-2、IFN-γ在第9周差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）�？剐灾旰兔舾兄晗啾�，抗性株感染小鼠血清細(xì)胞因子均低于敏感株，其中于用藥后第2周，江蘇株感染小鼠血清IFN-γ差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），湖南株感染小鼠血清IL-4、IL-5差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。研究顯示：吡喹酮抗性株和敏感株感染終宿主后，宿主免疫應(yīng)答強(qiáng)度不相同，對(duì)江蘇敏感株的應(yīng)答強(qiáng)于抗性株；吡喹酮治療后，機(jī)體對(duì)抗性株的應(yīng)答反應(yīng)則要強(qiáng)于敏感株。 結(jié)論 本研究試圖通過比較日本血吸蟲吡喹酮抗性株和敏感株成蟲和蟲卵的抗原組分差異；觀察吡喹酮對(duì)于抗性株和敏感株成蟲損傷的差異；以及抗性株和敏感株感染后及經(jīng)吡喹酮治療后感染終宿主體內(nèi)免疫反應(yīng)變化，以探討日本血吸蟲吡喹酮抗性株的免疫學(xué)特征，研究顯示：兩者抗原條帶組分無明顯差異，但泳道光密度分析顯示部分條帶光密度值間存在差異，相關(guān)抗原蛋白表達(dá)量存在上調(diào)或下調(diào)；吡喹酮對(duì)表層損傷程度存在差異，敏感株損傷程度重于抗性株；抗性株和敏感株感染及吡喹酮治療對(duì)輔助性T細(xì)胞亞群無明顯影響，但感染后宿主免疫應(yīng)答強(qiáng)度不相同，經(jīng)吡喹酮治療后，機(jī)體對(duì)抗性株的應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)于敏感株。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 吡喹酮抗性株 蛋白電泳 超微結(jié)構(gòu) 細(xì)胞因子 輔助性T細(xì)胞亞群
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 常用縮略語5-7
• 中文摘要7-13
• Abstract13-20
• 前言20-24
• 第一部分 日本血吸蟲吡喹酮抗性株及敏感株成蟲和蟲卵抗原組分分析24-40
• 材料和方法24-33
• 結(jié)果33-38
• 討論38-40
• 第二部分 吡喹酮對(duì)日本血吸蟲吡喹酮抗性株及敏感株成蟲皮層的損傷40-56
• 材料與方法40-44
• 結(jié)果44-54
• 討論54-56
• 第三部分 吡喹酮抗性株及敏感株感染及經(jīng)吡喹酮治療后宿主輔助性 T 細(xì)胞反應(yīng)性56-81
• 一 吡喹酮抗性株及敏感株感染及經(jīng)吡喹酮治療后對(duì)小鼠輔助性T細(xì)胞亞群的影響56-67
• 材料與方法56-61
• 結(jié)果61-67
• 二 吡喹酮抗性株及敏感株感染及經(jīng)吡喹酮治療后對(duì)小鼠輔助性T細(xì)胞因子的影響67-79
• 材料與方法67-70
• 結(jié)果70-79
• 討論79-81
• 全文結(jié)論81-82
• 不足與展望82-83
• 參考文獻(xiàn)83-88
• 文獻(xiàn)綜述88-93
• 參考文獻(xiàn)91-93
• 碩士在讀期間發(fā)表論文及參與課題93-94
• 致謝94

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱毅,張繼偉,于捷,孫培越,曹春楊,朱瑞,田國萍;高顱壓型腦囊蟲病術(shù)后服吡喹酮的組織病理學(xué)研究[J];臨床神經(jīng)外科雜志;2004年03期

2 朱毅,王U

本文編號(hào)：283501