本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌中對碳青霉烯類抗生素耐藥相關(guān)基因的篩選及研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是最常見的引起醫(yī)院內(nèi)感染的機(jī)會致病菌,對免疫力低下的人群易引起感染,特別是在器官移植病人、燒傷病人和肺纖維囊腫病人體內(nèi)極易引起感染。由于它對幾乎所有已知的抗生素都有很高的固有和獲得性耐藥,使目前臨床治療更加困難。 碳青霉烯類抗生素具有較強(qiáng)的抗菌活性和較低的毒性,是當(dāng)前臨床上治療PA感染的重要抗生素。由于該類抗生素在臨床上大量使用,PA對碳青霉烯類抗生素的耐藥率隨之迅猛提高,給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。因此,對該類抗生素耐藥機(jī)制的研究迫在眉睫。 為了探索PA對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制及尋找其耐藥相關(guān)基因,本研究中我們從PAO1的全基因組水平出發(fā),通過構(gòu)建含30000多個克隆的轉(zhuǎn)座突變體文庫,篩選了200多株分別對亞胺培南、美羅培南和比亞培南耐藥及敏感突變株,并通過隨機(jī)PCR、核苷酸測序及序列比對的方法確定了突變體中轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn),獲得了48個與碳青霉烯類抗生素耐藥相關(guān)的基因。其中有38個新的與碳青霉烯類耐藥相關(guān)基因,包括13個class4類,其余25個是首次發(fā)現(xiàn)與碳青霉烯類抗生素耐藥相關(guān)的基因。對這些新基因的發(fā)現(xiàn),不僅有利于全面了解PA的耐藥機(jī)制調(diào)控網(wǎng)絡(luò),更為有效治療PA感染提供了新的思路。 在所篩選的突變體中,有兩株菌被確定為PA0011轉(zhuǎn)座突變體,對美羅培南和比亞培南都耐藥。該基因編碼2-OH-十二烷酰轉(zhuǎn)移酶(2-OH-lauroytransferase),參與細(xì)菌外膜的合成。通過構(gòu)建PA0011基因的敲除突變體,主要探索了PA0011基因?qū)︺~綠假單胞菌耐藥性與致病性的影響。研究發(fā)現(xiàn)PA0011與多種抗生素耐藥相關(guān),包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類、青霉素類、四環(huán)素類、環(huán)丙沙星類及粘菌素類等。通過實(shí)驗(yàn)表明,PA0011對外膜完整性和穩(wěn)定性的維持具有重要作用,從而導(dǎo)致該基因突變體對抗生素的抗性降低。PA0011基因的表達(dá)受溫度的調(diào)節(jié),在21℃條件下比37℃的表達(dá)水平更高。溫度還影響突變體對抗生素的敏感性程度,在21℃條件下比37℃突變體對抗生素更敏感。 通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PA0011基因突變能夠?qū)е翽A毒性降低。內(nèi)毒素分析表明,毒性的降低部分是由于PA0011基因突變降低了PA的內(nèi)毒素活性。此外PA0011基因突變還會導(dǎo)致一些毒性因子表達(dá)降低,如PA的泳動能力。但該基因不影響人血清和小鼠巨噬細(xì)胞對PAO1的敏感性。 在沙門氏菌和銅綠假單胞菌中,LPS-O抗原修飾與TTSS毒性因子分泌密切相關(guān)。我們研究表明,銅綠假單胞菌LPS的�；揎椧才cTTSS毒性因子的表達(dá)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 碳青霉烯類抗生素 耐藥性 致病性 PA0011
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.991
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 圖目錄10-11
• 表目錄11-12
• 第一部分 引言12-23
• 1.1 銅綠假單胞菌及其對碳青霉烯類抗生素耐藥性研究12-14
• 1.1.1 銅綠假單胞菌12
• 1.1.2 碳青霉烯類抗生素12
• 1.1.3 銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制的研究現(xiàn)狀12-14
• 1.2 銅綠假單胞菌的致病性14-18
• 1.3 革蘭氏陰性菌的外膜18-19
• 1.3.1 外膜的通透性18-19
• 1.3.2 外膜的穩(wěn)定性19
• 1.4 革蘭氏陰性菌外膜結(jié)構(gòu)與其耐藥性的關(guān)系19-21
• 1.4.1 外膜蛋白與細(xì)菌耐藥的關(guān)系19
• 1.4.2 外膜組分類脂A的修飾與細(xì)菌耐藥的關(guān)系19-21
• 1.5 抗生素的分類及對PA治療的應(yīng)用21
• 1.6 研究內(nèi)容21-22
• 1.7 研究意義22-23
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)材料和方法23-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒23-24
• 2.1.2 培養(yǎng)基配制及使用24
• 2.1.3 抗生素及其使用24-25
• 2.1.4 試劑和儀器25
• 2.2 基本實(shí)驗(yàn)方法25-37
• 2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備25
• 2.2.2 銅綠假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞制備25
• 2.2.3 電轉(zhuǎn)化25-26
• 2.2.4 酶切和連接反應(yīng)26
• 2.2.5 PA0011基因敲除突變體的構(gòu)建26-28
• 2.2.6 PA0011基因表達(dá)報(bào)道載體的構(gòu)建28-29
• 2.2.7 PA0011基因敲除突變體的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.2.8 PA0011基因的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.9 轉(zhuǎn)座突變體庫的構(gòu)建31
• 2.2.10 抗生素MIC檢測及耐藥突變菌株的篩選31-32
• 2.2.11 突變體插入位點(diǎn)的確定32-33
• 2.2.12 PAO1(△0011)對多種抗生素敏感性檢測33
• 2.2.13 外膜滲透性和穩(wěn)定性檢測33
• 2.2.14 果蠅感染實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.2.15 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)34-35
• 2.2.16 LPS提取和純化35
• 2.2.17 細(xì)菌運(yùn)動性檢測35
• 2.2.18 血清敏感性檢測35
• 2.2.19 巨噬細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)35-36
• 2.2.20 蛋白提取36-37
• 第三部分 結(jié)果37-50
• 3.1 銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥相關(guān)基因的篩選37-40
• 3.1.1 轉(zhuǎn)座突變體庫的篩選結(jié)果37-38
• 3.1.2 耐藥相關(guān)基因的確定38-40
• 3.1.3 不同篩選研究中基因的比較40
• 3.2 PA0011基因與抗生素耐藥性的關(guān)系40-44
• 3.2.1 PAO1(△0011)對多種抗生素敏感性增加41-42
• 3.2.2 溫度影響PA0011基因的表達(dá)及其對抗生素敏感性42-43
• 3.2.3 PA0011基因影響銅綠假單胞菌外膜結(jié)構(gòu)43-44
• 3.3 PA0011銅綠假單胞菌致病性的關(guān)系44-50
• 3.3.1 PAO1(△0011)降低了對果蠅的感染44
• 3.3.2 PA0011對細(xì)胞毒性的影響44-45
• 3.3.3 PA0011影響細(xì)菌內(nèi)毒性的活性45-46
• 3.3.4 PA0011不影響正常人血清和小鼠巨噬細(xì)胞的敏感性46
• 3.3.5 PA0011對銅綠假單胞菌毒性因子的影響46-50
• 第四部分 結(jié)果與討論50-52
• 4.1 結(jié)果50
• 4.2 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-61
• 致謝61-62
• 碩士期間研究成果62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 宋宏新;劉曉陽;李宏;;改良熱酚水法制備大腸桿菌O157:H7脂多糖抗原的研究[J];食品科學(xué);2006年10期

2 康海泓;楊倩;;細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)裝配的研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2010年04期

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌中對碳青霉烯類抗生素耐藥相關(guān)基因的篩選及研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：276678