本文關(guān)鍵詞：皮質(zhì)酮對小鼠海馬HT-22細胞游離鋅含量的影響及其機制探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 面對復(fù)雜而多變的生存環(huán)境，機體經(jīng)常處于一種應(yīng)激狀態(tài)，對應(yīng)激源產(chǎn)生著適應(yīng)性和防御性的非特異性反應(yīng)。給予任何外源性的生物應(yīng)激，機體都能產(chǎn)生非特異性反應(yīng)以恢復(fù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids, GC)是重要的應(yīng)激激素，機體在發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)，大量分泌該激素。在小鼠體內(nèi)，主要的應(yīng)激激素是皮質(zhì)酮(Corticosterone, CORT)，機體在應(yīng)激時，由腎上腺皮質(zhì)細胞大量分泌該激素。 海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵腦區(qū)，一方面與學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)，另一方面海馬比其他腦區(qū)集中了更高濃度的糖皮質(zhì)激素受體，因此是對應(yīng)激特別敏感、易受應(yīng)激損傷的腦區(qū)。海馬齒狀回顆粒細胞苔蘚纖維終末突觸小泡內(nèi)聚集大量的鋅離子，作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)與神經(jīng)遞質(zhì)共同釋放到突觸間隙，調(diào)節(jié)細胞的信號識別、第二信使代謝、蛋白激酶和蛋白磷酸酶活化，并且鋅離子可能激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子的活化，發(fā)揮重要生理功能。 鋅對于所有機體都是必需的，由于鋅的催化性和結(jié)構(gòu)功能使其在很多酶類和蛋白質(zhì)中檢測到，鋅相比其他過渡金屬元素，有更廣泛的功能，如鋅離子具有重要的信號調(diào)節(jié)作用。鋅離子是腦內(nèi)含量最豐富的陽離子之一，多數(shù)以結(jié)合形式存在，僅有一小部分以游離態(tài)存在于神經(jīng)元內(nèi)，主要存在于興奮性含鋅神經(jīng)元軸突終末。細胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)對病理生理環(huán)境因素的改變非常敏感，在應(yīng)激狀態(tài)下，檢測到多種細胞游離鋅離子顯著增加。鋅的重要功能使鋅缺乏與機體的多種功能紊亂相關(guān)，但另一方面過量的鋅對細胞也會產(chǎn)生毒性作用，細胞內(nèi)游離鋅離子過度增加可能改變細胞內(nèi)的氧化狀態(tài)，還可能引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致細胞壞死或凋亡。 我們推測：微量元素鋅在應(yīng)激過程中可能具有重要作用。應(yīng)激導(dǎo)致細胞鋅穩(wěn)態(tài)變化，影響細胞內(nèi)鋅的重新分布，導(dǎo)致胞內(nèi)游離鋅濃度上升，使鋅在胞內(nèi)產(chǎn)生毒性作用，造成細胞氧化狀態(tài)的改變。 實驗?zāi)康?本研究通過觀察皮質(zhì)酮對小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細胞游離鋅含量的變化規(guī)律，并對上述變化的可能機制進行探討，并檢測其對細胞活性和ROS水平、ATP水平的影響，不僅有助于了解糖皮質(zhì)激素在應(yīng)激過程中對神經(jīng)細胞內(nèi)游離鋅水平的影響，而且在此基礎(chǔ)上為研究應(yīng)激相關(guān)疾病提供實驗依據(jù)和理論參考。 實驗方法 1、細胞培養(yǎng)與處理 HT-22細胞，是小鼠海馬細胞系神經(jīng)元細胞株，由加拿大沙克研究所David Schubert博士饋贈。使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)細胞。進行細胞分化時棄去上述培養(yǎng)液，加入含1×N2的Neuro Basal培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。 分別采用10μΜ濃度CORT不同時間(0h、3h、6h、12h、24h)和不同濃度CORT(500nM、1μΜ、10μΜ、50μΜ)處理HT-22細胞6h。 2、HT-22細胞游離鋅含量的測定 收集細胞后使用含1mM Fluozin-3-AM的HBSS培養(yǎng)液避光孵育HT-22細胞30min，采用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm下測定HT-22細胞內(nèi)Fluozin-3-AM熒光強度。 3、HT-22細胞總鋅含量的測定 收集細胞后加入100μl的濃硝酸在80℃條件下消化HT-22細胞，待液體蒸干后，加入50μl的濃硝酸溶解殘留物，然后用Milli-Q水定容至2ml，采用原子吸收分光光度計火焰法測定胞內(nèi)總鋅含量。 4、HT-22細胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表達量的測定 采用實時定量熒光PCR法測定HT-22細胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA的表達水平。 5、HT-22細胞活性的測定 采用CCK-8試劑盒檢測HT-22細胞活性。 6、HT-22細胞ROS水平的測定 采用ROS試劑盒測定HT-22細胞活性氧水平。 7、HT-22細胞ATP水平的測定 采用ATP檢測試劑盒測定HT-22細胞ATP水平。 8、統(tǒng)計方法 使用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，進行數(shù)據(jù)匯總及繪圖使用Excel2007軟件，檢驗水準選擇α=0.05；采用兩樣本t檢驗和one-way ANVOA、Dunnett’s、Newman-Keuls進行多樣本間比較。 實驗結(jié)果 1、CORT對HT-22細胞游離鋅含量的影響 實驗結(jié)果顯示，10μΜ CORT處理HT-22細胞不同時間，與對照組相比，6h、12h組游離鋅含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。不同濃度CORT處理HT-22細胞6h，與對照組相比，10μΜ CORT組游離鋅含量升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。先加入糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU4860.5h，再加入CORT處理HT-22細胞，與對照組相比，不能引起胞內(nèi)游離鋅含量升高。 2、CORT對HT-22細胞總鋅含量的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，單純CORT組胞內(nèi)總鋅含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。加入RU486組總鋅含量與對照組無明顯變化。 3、硫酸鋅對CORT處理的HT-22細胞游離鋅含量的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨加入硫酸鋅后，胞內(nèi)游離鋅含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與CORT組相比，加入硫酸鋅+CORT后，胞內(nèi)游離鋅含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 4、鋅離子螯合劑對CORT處理的HT-22細胞游離鋅含量的影響 （1）DTPA對CORT處理的HT-22細胞游離鋅含量的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，DTPA組胞內(nèi)游離鋅含量沒有明顯變化(P0.05)；與CORT組相比，DTPA+CORT組胞內(nèi)游離鋅含量有所降低，但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 （2）TPEN對CORT處理的HT-22細胞游離鋅含量的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，TPEN組胞內(nèi)游離鋅含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與CORT組相比，TPEN+CORT組胞內(nèi)游離鋅含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 5、CORT對HT-22細胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表達水平的影響 熒光實時定量PCR實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，10μΜ CORT處理HT-22細胞6h后，細胞內(nèi)MT1、MT3mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；鋅轉(zhuǎn)運體ZIP1、ZnT1和ZnT3mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 6、CORT處理HT-22細胞后對細胞活性的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度CORT處理6h，10μΜ組細胞活性無明顯變化(P0.05)，50μΜ組細胞活性減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同一濃度CORT10μM處理HT-22細胞不同時間，6h組細胞活性無明顯變化(P0.05)，12h、24h組細胞活性減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 7、CORT處理HT-22細胞后對細胞ROS水平的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，10μΜ CORT處理HT-22細胞6h后細胞活性氧水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與CORT組相比，TPEN+CORT組細胞活性氧水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與對照組相比，硫酸鋅組細胞活性氧水平升高(P0.01)；與硫酸鋅組相比，硫酸鋅+CORT組細胞活性氧水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 8、CORT處理HT-22細胞后對細胞ATP水平的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，10μΜ CORT處理HT-22細胞6h后ATP水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與CORT組相比，TPEN+CORT組細胞ATP水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與對照組相比，硫酸鋅組細胞ATP水平降低(P0.01)；與硫酸鋅組相比，硫酸鋅+CORT組細胞ATP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論 本研究通過CORT刺激HT-22細胞，觀察應(yīng)激情況下的細胞內(nèi)游離鋅含量變化及通過添加硫酸鋅與鋅離子螯合劑、熒光實時定量PCR對游離鋅變化的機制進行探討，并進一步觀察CORT對HT-22細胞活性及ROS水平、ATP水平的影響。主要結(jié)論如下： 1、CORT刺激可以導(dǎo)致HT-22細胞游離鋅水平升高。 2、CORT使胞內(nèi)游離鋅含量增加可能主要是因為CORT促進胞內(nèi)結(jié)合態(tài)的鋅釋放。 3、CORT使HT-22細胞內(nèi)結(jié)合態(tài)鋅解離釋放出大量游離鋅，導(dǎo)致MT和鋅轉(zhuǎn)運體的表達發(fā)生變化，使釋放到胞外的鋅離子增加，總鋅含量降低。 4、CORT刺激HT-22細胞，使胞內(nèi)游離鋅含量升高，導(dǎo)致細胞ROS水平升高，ATP水平降低，可能對線粒體的功能造成影響。
【關(guān)鍵詞】：皮質(zhì)酮 海馬 HT-22細胞 游離鋅 應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要5-10
• Abstract10-16
• 英文縮略詞表16-17
• 前言17-20
• 參考文獻18-20
• 第一部分 CORT 對 HT-22 細胞游離鋅含量的影響20-32
• 一、材料與方法20-25
• 二、實驗結(jié)果25-29
• 三、討論29-30
• 四、小結(jié)30
• 參考文獻30-32
• 第二部分 CORT 對 HT-22 細胞游離鋅含量變化的機制探討32-47
• 一、材料方法32-36
• 二、實驗結(jié)果36-42
• 三、討論42-45
• 四、小結(jié)45
• 參考文獻45-47
• 第三部分 CORT 對 HT-22 細胞活性、ROS 水平及 ATP 水平的影響47-59
• 一、材料與方法47-50
• 二、實驗結(jié)果50-54
• 三、討論54-56
• 四、小結(jié)56
• 參考文獻56-59
• 全文總結(jié)59-60
• 綜述60-67
• 參考文獻64-67
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況67-68
• 致謝68

【共引文獻】

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本文編號：270586