目的: TAT是最早被發(fā)現(xiàn)并被用于在體外和體內(nèi)向胞內(nèi)運送蛋白分子的細胞膜穿透肽,研究發(fā)現(xiàn),其穿膜效率并不理想,亟需探索更佳穿膜條件以提高TAT穿膜效率。以二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)預處理體外培養(yǎng)的多種細胞,觀察TAT穿膜效率的變化,以期優(yōu)化TAT穿膜條件,為其推廣應用提供實驗基礎(chǔ)。 方法:1)化學合成熒光標記短肽TAT-FITC和NCO-FITC,DMSO預處理Caski、Siha、HepG2、A549、COS7細胞株后觀察TAT的穿膜情況,通過熒光顯微鏡下觀察或熒光定量,優(yōu)化TAT的穿膜條件。2)通過紅細胞裂解實驗和乳酸脫氫酶釋放實驗評價DMSO處理紅細胞及各細胞株后細胞膜的完整性,MTT檢測DMSO預處理對各種細胞株細胞活力的影響,熒光定量檢測DMSO預處理細胞是否改變TAT的穿膜方式。3)構(gòu)建GFP、Apoptin、TAT-GFP、TAT-Apoptin原核表達質(zhì)粒。經(jīng)PCR、雙酶切及序列分析重組原核表達質(zhì)粒構(gòu)建的正確性;用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導表達后通過Ni-NTA親和層析純化蛋白GFP、Apoptin、TAT-GFP和TAT-Apoptin,Western blot法鑒定融合蛋白表達的正確性。4)熒光顯微鏡下觀察DMSO預處理Caski細胞后融合蛋白TAT-GFP的穿膜效率,TUNEL法檢測DMSO預處理Caski細胞后融合蛋白TAT-Apoptin發(fā)揮誘導細胞凋亡的生物學活性。 結(jié)果:1) 10% DMSO預處理各細胞株后TAT穿膜效率明顯增強,胞內(nèi)熒光分布均勻,胞核較胞漿濃集,NCO對照組胞內(nèi)未見熒光分布;血清的存在降低DMSO對TAT穿膜效應的增強作用。2) DMSO不影響紅細胞及多種細胞株的細胞膜完整性;不同細胞對DMSO處理2小時后各細胞株活力影響均較小且不同細胞株對其敏感程度不同;DMSO預處理細胞后不改變TAT的穿膜方式。3)經(jīng)PCR、雙酶切及DNA測序確定成功構(gòu)建出GFP、Apoptin、TAT-GFP、TAT-Apoptin的原核表達質(zhì)粒;誘導表達并純化制備出蛋白;Western blot法檢測融合蛋白表達質(zhì)粒在E. coli BL21(DE3)中正確表達。4)熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Caski細胞在經(jīng)10% DMSO預處理后TAT-GFP融合蛋白能高效穿膜并在胞內(nèi)均勻分布;通過TUNEL檢測DMSO預處理增強了TAT-Apoptin融合蛋白進入細胞并發(fā)揮誘導Caski細胞凋亡的生物學活性。 結(jié)論:1) 10%的DMSO預處理可以增強TAT-FITC的穿膜效率并使其在胞內(nèi)均勻分布;2) DMSO預處理細胞后并不影響細胞膜的完整性,對細胞活力影響較小;3) DMSO預處理細胞后并不改變TAT的穿膜機制;4) DMSO預處理細胞后可增強TAT-GFP蛋白的穿膜效應和TAT-Apoptin介導的誘導腫瘤細胞凋亡的生物學活性。
【學位授予單位】：三峽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：2206321