目的: TAT是最早被發(fā)現(xiàn)并被用于在體外和體內(nèi)向胞內(nèi)運(yùn)送蛋白分子的細(xì)胞膜穿透肽,研究發(fā)現(xiàn),其穿膜效率并不理想,亟需探索更佳穿膜條件以提高TAT穿膜效率。以二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)預(yù)處理體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞,觀察TAT穿膜效率的變化,以期優(yōu)化TAT穿膜條件,為其推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:1)化學(xué)合成熒光標(biāo)記短肽TAT-FITC和NCO-FITC,DMSO預(yù)處理Caski、Siha、HepG2、A549、COS7細(xì)胞株后觀察TAT的穿膜情況,通過熒光顯微鏡下觀察或熒光定量,優(yōu)化TAT的穿膜條件。2)通過紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)和乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DMSO處理紅細(xì)胞及各細(xì)胞株后細(xì)胞膜的完整性,MTT檢測(cè)DMSO預(yù)處理對(duì)各種細(xì)胞株細(xì)胞活力的影響,熒光定量檢測(cè)DMSO預(yù)處理細(xì)胞是否改變TAT的穿膜方式。3)構(gòu)建GFP、Apoptin、TAT-GFP、TAT-Apoptin原核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)PCR、雙酶切及序列分析重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性;用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后通過Ni-NTA親和層析純化蛋白GFP、Apoptin、TAT-GFP和TAT-Apoptin,Western blot法鑒定融合蛋白表達(dá)的正確性。4)熒光顯微鏡下觀察DMSO預(yù)處理Caski細(xì)胞后融合蛋白TAT-GFP的穿膜效率,TUNEL法檢測(cè)DMSO預(yù)處理Caski細(xì)胞后融合蛋白TAT-Apoptin發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。 結(jié)果:1) 10% DMSO預(yù)處理各細(xì)胞株后TAT穿膜效率明顯增強(qiáng),胞內(nèi)熒光分布均勻,胞核較胞漿濃集,NCO對(duì)照組胞內(nèi)未見熒光分布;血清的存在降低DMSO對(duì)TAT穿膜效應(yīng)的增強(qiáng)作用。2) DMSO不影響紅細(xì)胞及多種細(xì)胞株的細(xì)胞膜完整性;不同細(xì)胞對(duì)DMSO處理2小時(shí)后各細(xì)胞株活力影響均較小且不同細(xì)胞株對(duì)其敏感程度不同;DMSO預(yù)處理細(xì)胞后不改變TAT的穿膜方式。3)經(jīng)PCR、雙酶切及DNA測(cè)序確定成功構(gòu)建出GFP、Apoptin、TAT-GFP、TAT-Apoptin的原核表達(dá)質(zhì)粒;誘導(dǎo)表達(dá)并純化制備出蛋白;Western blot法檢測(cè)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒在E. coli BL21(DE3)中正確表達(dá)。4)熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Caski細(xì)胞在經(jīng)10% DMSO預(yù)處理后TAT-GFP融合蛋白能高效穿膜并在胞內(nèi)均勻分布;通過TUNEL檢測(cè)DMSO預(yù)處理增強(qiáng)了TAT-Apoptin融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮誘導(dǎo)Caski細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。 結(jié)論:1) 10%的DMSO預(yù)處理可以增強(qiáng)TAT-FITC的穿膜效率并使其在胞內(nèi)均勻分布;2) DMSO預(yù)處理細(xì)胞后并不影響細(xì)胞膜的完整性,對(duì)細(xì)胞活力影響較小;3) DMSO預(yù)處理細(xì)胞后并不改變TAT的穿膜機(jī)制;4) DMSO預(yù)處理細(xì)胞后可增強(qiáng)TAT-GFP蛋白的穿膜效應(yīng)和TAT-Apoptin介導(dǎo)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。
【學(xué)位授予單位】：三峽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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2 王琥;柳長柏;黃宇彬;;溫度、血清以及肝素等因素對(duì)TAT穿膜效應(yīng)的影響[J];生物技術(shù);2010年02期

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3 彭冬君;Apoptin在腫瘤治療和腫瘤發(fā)生機(jī)制研究中的應(yīng)用[D];華中科技大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：2206321