【摘要】： 本文探討了藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)對體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞抗腫瘤作用的研究,并闡述了其調控p53-p21-pRB途徑誘導人乳腺癌MCF-7細胞衰老的分子機制。 在體外研究中,利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法,發(fā)現藻紅蛋白可抑制人乳腺癌MCF-7細胞的生長,抑制效果明顯,其IC50為134.87μg·mL-1。 通過形態(tài)學鑒定藻紅蛋白對腫瘤細胞衰老作用,用β-半乳糖苷酶染色試劑盒,DAPI染色液對腫瘤細胞染色,利用普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡進行觀察,發(fā)現腫瘤細胞出現典型的衰老特征：腫瘤細胞變大變扁平,細胞皺縮、胞質內空泡形成,并出現發(fā)芽起泡現象。經β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法染色,倒置顯微鏡觀察,發(fā)現給藥組細胞分泌衰老特征性β-半乳糖苷酶含量增加,經染料染色,生成藍色物質。DAPI染色法熒光顯微鏡觀察,給藥組細胞核中DNA顯示點狀聚集分布,并且隨著藻紅蛋白濃度的遞增,現象越來越明顯,表明細胞衰老的比例不斷增加。 隨后,利用Fluo-3/AM進行染色,采用激光共聚焦顯微鏡檢測藻紅蛋白對腫瘤細胞中鈣離子濃度的影響。研究發(fā)現,隨著藻紅蛋白濃度的遞增,藻紅蛋白能夠明顯升高腫瘤細胞中鈣離子的濃度。且呈現一定的劑量依賴關系。利用TMRE進行染色,采用激光共聚焦顯微鏡檢測藻紅蛋白對腫瘤細胞中線粒體膜電位的影響。研究發(fā)現,隨著藻紅蛋白濃度的不斷增大,藻紅蛋白能夠明顯降低腫瘤細胞中線粒體膜電位。利用2',7'-二氯氫化熒光素二脂(DCFH-DA)對腫瘤細胞染色,采用激光共聚焦顯微鏡檢測藻紅蛋白對腫瘤細胞中活性氧含量的影響。研究發(fā)現,隨著藻紅蛋白濃度的升高,腫瘤細胞中活性氧的含量也不斷增加。在此基礎上,我們初步考察了藻紅蛋白誘導腫瘤細胞衰老的途徑。在激光共聚焦顯微鏡下觀察,不同濃度的藻紅蛋白作用人乳腺癌MCF-7細胞48h后,腫瘤細胞內的p53、p21和pRB蛋白的熒光強度均增強,并且隨著藻紅蛋白濃度的增加,p53、p21和pRB蛋白的熒光強度也隨之增強,說明藻紅蛋白能誘導人乳腺癌MCF-7細胞表達衰老相關蛋白p53、p21及pRB。 綜上所述,本課題通過體外實驗證明了藻紅蛋白對人乳腺癌MCF-7細胞具有明顯的抗腫瘤活性。通過形態(tài)學觀察,藻紅蛋白能誘導腫瘤細胞出現典型的衰老特征。在機制作用方面,可能與其可通過提高腫瘤細胞內鈣離子濃度和增加腫瘤細胞內活性氧的產生,從而激活細胞衰老的啟動蛋白-p53蛋白,從而誘導細胞衰老的發(fā)生。總之,藻紅蛋白在體外具有明顯的抗腫瘤作用且藻紅蛋白能通過調控p53-p21-pRB途徑誘導人乳腺癌MCF-7細胞衰老。
[Abstract]:In this paper, the antitumor effect of phycoerythrin (PE) on human breast cancer MCF-7 cells in vitro was studied, and the molecular mechanism of its regulation of p53-p21-pRB pathway on the senescence of human breast cancer MCF-7 cells was discussed. In vitro, phycoerythrin was found to inhibit the growth of human breast cancer MCF-7 cells by tetramethyl azolium salt (MTT) colorimetry. The inhibitory effect of phycoerythrin on the growth of human breast cancer MCF-7 cells was significant, and its IC50 was 134.87 渭 g ml -1. The aging effect of phycoerythrin on tumor cells was identified by morphology. The tumor cells were stained with 尾 -galactosidase staining kit DAPI staining solution, and observed by ordinary optical microscope and fluorescence microscope. The typical aging characteristics of tumor cells were found: the tumor cells became larger and flattened, the cells shrank, vacuoles formed in the cytoplasm, and sprouting and bubbling occurred. The 尾 -galactosidase (SA- 尾 -gal) staining and the observation of inverted microscope showed that the content of 尾 -galactosidase was increased in the cells of the administration group. The distribution of DNA in the nucleus of the drug treatment group showed the dot aggregation distribution, and with the increase of phycoerythrin concentration, the phenomenon became more and more obvious, which indicated that the proportion of cell senescence was increasing. Then, the effect of phycoerythrin on calcium concentration in tumor cells was detected by Fluo-3/AM staining and confocal laser microscopy. It was found that with the increase of phycoerythrin concentration, phycoerythrin could significantly increase the calcium concentration in tumor cells. There was a dose-dependent relationship. The effects of phycoerythrin on mitochondrial membrane potential in tumor cells were detected by TMRE staining and confocal laser microscopy. It was found that phycoerythrin could significantly decrease mitochondrial membrane potential in tumor cells with the increasing of phycoerythrin concentration. The effect of phycoerythrin on the content of reactive oxygen species (Ros) in tumor cells was detected by laser confocal microscopy (LSCM). The tumor cells were stained with DCFH-DA and the effect of phycoerythrin on the content of reactive oxygen species (Ros) in tumor cells was detected by confocal laser microscopy. It was found that the content of reactive oxygen species in tumor cells increased with the increase of phycoerythrin concentration. On this basis, we preliminarily investigated the pathway of phycoerythrin induced tumor cell senescence. Under confocal laser microscope, the fluorescence intensity of p53, p21 and pRB proteins in human breast cancer MCF-7 cells increased after 48 h treatment with different concentrations of phycoerythrin. With the increase of phycoerythrin concentration, the fluorescence intensity of p53 p21 and pRB protein was also increased, which indicated that phycoerythrin could induce the expression of senescence related proteins p53, p21 and PRB in human breast cancer MCF-7 cells. In conclusion, phycoerythrin has obvious antitumor activity on human breast cancer MCF-7 cells in vitro. By morphological observation, phycoerythrin can induce typical senescence of tumor cells. In terms of mechanism, it may activate the promoter protein -p53 protein of cell senescence by increasing the concentration of calcium ions in tumor cells and increasing the production of reactive oxygen species in tumor cells, thus inducing the occurrence of cell senescence. In conclusion, phycoerythrin has obvious antitumor effect in vitro, and phycoerythrin can induce human breast cancer MCF-7 cell senescence by regulating p53-p21-pRB pathway.
【學位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346;R737.9

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本文編號：2198740