發(fā)布時間：2018-08-12 18:32

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus, RV)是導(dǎo)致5歲以下嬰幼兒急性腹瀉的最主要病原,每年導(dǎo)致60萬人死亡,嚴(yán)重危害人類健康,目前其致病機(jī)制尚不清楚。闡明RV的致病機(jī)制,尤其是其逃逸宿主免疫防御機(jī)理,將為新型抗RV策略及疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。 RV非結(jié)構(gòu)蛋白1(NSP1)在RV拮抗宿主天然免疫應(yīng)答中起重要作用,其功能尚不完全清楚。目前的研究表明,NSP1蛋白可以通過介導(dǎo)干擾素調(diào)控因子(IRF)家族蛋白的降解,以及通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的活化來阻斷干擾素(IFN)信號通路,從而拮抗宿主抗病毒應(yīng)答。然而,有證據(jù)表明不同種屬來源RV NSP1同源性較低,而且不同NSP1蛋白與天然免疫的作用方式可能存在差異,如豬RVOSU株NSP1蛋白的IRF結(jié)合結(jié)構(gòu)域并不能介導(dǎo)IRF蛋白的降解。這提示不同來源NSP1可能通過多種途徑拮抗宿主天然免疫。鑒此,本研究擬進(jìn)一步探索NSP1與IFN信號通路相互作用的靶點(diǎn),深入探討NSP1拮抗宿主天然免疫機(jī)理,并通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析NSP1的表達(dá)對宿主細(xì)胞蛋白的調(diào)控,以期深入了解NSP1的功能。 一、NSP1拮抗宿主天然免疫機(jī)理研究 首先我們觀察到已知通過降解IRF抑制IFN應(yīng)答的RV毒株的NSP1在缺失IRF結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域后,仍可以抑制IFN-β啟動子活性,提示NSP1存在其它拮抗IFN作用靶點(diǎn)。免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)NSP1可以與維甲酸誘導(dǎo)基因I (RIG-I)結(jié)合,并降低RIG-I蛋白表達(dá),而且人、猴、豬等不同種屬來源的RV NSP1均可以下調(diào)RIG-I.在RV感染時,我們發(fā)現(xiàn)隨著病毒復(fù)制增加,RIG-I也出現(xiàn)表達(dá)量的變化,感染后4h RIG-I表達(dá)增加,而從感染后12h開始RIG-I表達(dá)逐漸減少,提示RIG-I在RV感染中確實(shí)被抑制。NSP1擁有RING結(jié)構(gòu)域,但是否具有泛素連接酶活性尚未被直接證實(shí)。我們證實(shí)NSP1為泛素E3連接酶,可以增強(qiáng)細(xì)胞泛素化及自身泛素化,并且泛素連接酶功能與N端RING結(jié)構(gòu)域相關(guān)。但是NSP1對RIG-I的抑制作用可能不是通過泛素-蛋白酶體途徑。生物信息學(xué)預(yù)測表明,RIG-I中擁有Caspase1的切割位點(diǎn),RIG-I是否通過激活Caspasel切割RIG-I拮抗其作用尚需要進(jìn)一步研究。 作為模式識別受體,RIG-I在機(jī)體監(jiān)測入侵RV并啟動天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮了極其重要的作用,本研究首次發(fā)現(xiàn)了NSP1可以減少RIG-I蛋白表達(dá),以拮抗宿主IFN應(yīng)答,該研究結(jié)果揭示RIG-I為NSP1作用新靶點(diǎn),進(jìn)一步豐富了對于RV逃逸宿主天然免疫機(jī)制的認(rèn)識。 二、NSP1對宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響 為了進(jìn)一步闡明NSP1的作用機(jī)制,我們利用熒光差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定研究了過表達(dá)NSP1蛋白對宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響。過表達(dá)NSP1后,初步鑒定到12個差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中4個表達(dá)上調(diào),8個表達(dá)下調(diào)。通過Western blot分析,我們對表達(dá)下調(diào)差異蛋白質(zhì)Prohibitin、ERP29進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果與DIGE結(jié)果一致。Gene Ontology分析顯示差異表達(dá)蛋白涉及細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子伴侶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能。隨后我們研究了表達(dá)上調(diào)的波形蛋白(Vimentin)和NSP1相互作用。免疫熒光顯示RV感染后,波形蛋白細(xì)胞定位發(fā)生重新排列,提示波形蛋白可能與病毒復(fù)制和裝配有關(guān)。進(jìn)而我們利用激光共聚焦方法觀察了轉(zhuǎn)染NSP1后波形蛋白細(xì)胞定位變化,結(jié)果顯示,不表達(dá)NSP1蛋白的細(xì)胞中,波形蛋白成網(wǎng)狀纖維分布,而表達(dá)NSP1的細(xì)胞中,波形蛋白形成聚集體,并與NSP1蛋白共定位,提示NSP1蛋白表達(dá)可能是導(dǎo)致RV感染后波形蛋白發(fā)生重新排列的原因之一,NSP1通過與細(xì)胞骨架相互作用參與病毒復(fù)制。這些結(jié)果為進(jìn)一步了解NSP1功能提供研究方向。 綜上所述,本研究首次揭示了RV可拮抗RIG-I而抑制天然免疫,且可調(diào)控細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)和定位,這些發(fā)現(xiàn)為深入研究RV拮抗天然免疫的機(jī)制和RV復(fù)制機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Rotavirus (RV) is the main pathogen causing acute diarrhea in infants under 5 years old. It causes 600,000 deaths every year and seriously endangers human health.
The function of RV nonstructural protein 1 (NSP1) in antagonizing the innate immune response of RV host is not fully understood. Recent studies have shown that NSP1 can block the interferon (IFN) signaling pathway by mediating the degradation of interferon regulatory factor (IRF) family proteins and inhibiting the activation of nuclear transcription factor kappa B (NF-kappa B). However, there is evidence that the homology of RV NSP1 from different sources is relatively low, and there may be differences between the different NSP1 proteins and the way of innate immunity. For example, the IRF binding domain of NSP1 protein of pig RVOSU strain can not mediate the degradation of IRF protein. This suggests that NSP1 from different sources may antagonize host by many ways. In view of this, this study intends to further explore the target of interaction between NSP1 and IFN signaling pathway, explore the mechanism of NSP1 antagonizing host innate immunity, and analyze the regulation of NSP1 expression on host cell proteins by differential proteomics technology, in order to understand the function of NSP1.
Antagonistic effect of NSP1 on host's innate immunity
Firstly, we observed that NSP1, a virus strain known to inhibit IFN response by degrading IRF, could inhibit the activity of IFN-beta promoter even after the loss of IRF binding domain, suggesting that NSP1 had other targets for antagonizing IFN. Immunoprecipitation analysis showed that NSP1 could bind to RIG-I and decrease the expression of RIG-I protein. Moreover, RV NSP1 of different sources of human, monkey and pig can downregulate RIG-I. when RV infection. We found that with the increase of viral replication, RIG-I also showed changes in expression level, 4h RIG-I expression increased after infection, and RIG-I expression decreased gradually from 12h after infection, suggesting that RIG-I was indeed inhibited in the infection of RV, but the latter had a structure domain. Whether NSP1 has ubiquitin-ligase activity has been directly confirmed. We have confirmed that NSP1 is a ubiquitin-E3 ligase that enhances cell ubiquitination and self-ubiquitination, and that ubiquitin-ligase function is related to the N-terminal RING domain. However, the inhibition of NSP1 on RIG-I may not be through the ubiquitin-proteasome pathway. Bioinformatics predicts that RI The cleavage site of Caspase 1 is present in G-I. Whether RIG-I antagonizes the cleavage of RIG-I by activating Caspasel needs further study.
As a pattern recognition receptor, RIG-I plays an extremely important role in monitoring the invasion of RV and initiating innate immune response. This study found for the first time that NSP1 can reduce the expression of RIG-I protein to antagonize host IFN response. The results reveal that RIG-I is a new target for NSP1 and further enrich the innate immune mechanism for RV escaping host. Understanding of system.
Two, the effect of NSP1 on the proteome of host cells.
To further elucidate the mechanism of NSP1, we studied the effect of overexpression of NSP1 protein on the proteome of host cells by fluorescence differential gel electrophoresis (DIGE) and mass spectrometry. After overexpression of NSP1, 12 differentially expressed proteins were identified, of which 4 were up-regulated and 8 were down-regulated. Gene Ontology analysis showed that the differentially expressed proteins involved cytoskeleton, signal transduction, molecular chaperone, transcriptional regulation and other functions. Then we studied the interaction between up-regulated waveform protein (Vimentin) and NSP1. The localization of vimentin cells was rearranged after infection, suggesting that vimentin might be involved in viral replication and assembly. Laser confocal microscopy was used to observe the localization of vimentin cells after NSP1 transfection. These results suggest that the expression of NSP1 protein may be one of the causes of vimentin rearrangement after RV infection. NSP1 is involved in virus replication through cytoskeleton interaction. These results provide a new direction for further understanding the function of NSP1.
In conclusion, this study reveals for the first time that RV can antagonize RIG-I and inhibit innate immunity, and can regulate the expression and localization of vimentin in cells. These findings lay a foundation for further study of the mechanism of RV antagonizing innate immunity and RV replication.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R373

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6 張U

本文編號：2179931