本文選題：幽門螺桿菌 + 空泡毒素��； 參考：《南華大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的:構(gòu)建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表達(dá)載體,研究幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)空泡毒素單一毒力決定簇對THP-1巨噬細(xì)胞分泌和凋亡的影響,以及核因子kappa B (nuclear factor kappa B,NF-κB)在調(diào)節(jié)VacA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞功能中的作用。 方法:用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增vacA全基因;將PCR產(chǎn)物純化后插入真核表達(dá)載體pDsRed-Monomer-C1中,經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后,轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞中,Western-blot鑒定VacA蛋白在細(xì)胞中的表達(dá);電子顯微鏡和中性紅攝取試驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞的空泡樣變;ELISA法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清IL- 1β、TNF-α含量;Griess試劑分析培養(yǎng)上清的NO水平;熒光探針DCFH-DA檢測培養(yǎng)上清的ROS;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率;凝膠阻滯試驗(yàn)(electrophoretic mobility gel shift assay ,EMSA)檢測NF-κB的核轉(zhuǎn)位。 結(jié)果: (1)雙酶切及測序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pDsRed-Monomer-C1/vacA; (2)轉(zhuǎn)染后24h用倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),空質(zhì)粒組表達(dá)的單純紅色熒光蛋白,其熒光在細(xì)胞內(nèi)呈彌散性分布,而重組質(zhì)粒組表達(dá)的VacA與紅色熒光蛋白的融合蛋白,在細(xì)胞質(zhì)形成聚集的熒光顆粒;Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)一條免疫反應(yīng)帶,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和THP-1巨噬細(xì)胞組未見免疫反應(yīng)帶; (3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞24h,部分細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不等的空泡;中性紅攝取實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后6h,重組質(zhì)粒組中性紅攝取量明顯升高,與對照組相比差異有顯著性(P 0.05);而轉(zhuǎn)染后24h,重組質(zhì)粒組的吸光度達(dá)到最高; (4)轉(zhuǎn)染后6h,重組質(zhì)粒組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量明顯高于陰性對照組(P0.05);且分別于轉(zhuǎn)染后6h或24h到達(dá)峰值; (5)轉(zhuǎn)染后6h或12h,重組質(zhì)粒組培養(yǎng)上清中NO、ROS含量明顯高于陰性對照組(P0.05);且于轉(zhuǎn)染后24h達(dá)到高峰; (6)轉(zhuǎn)染后16h,重組質(zhì)粒組的凋亡率明顯升高,與陰性對照組相比,差異有顯著性(P㩳0.05); (7)重組質(zhì)粒組加NF-κB的特異性抑制劑PDTC后,IL-1β、TNF-α、NO、ROS的分泌量和細(xì)胞的凋亡率明顯降低,與重組質(zhì)粒組相比差異有顯著性(P 0.05); (8) EMSA實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染后3h細(xì)胞核內(nèi)有活化的NF-κB,且于轉(zhuǎn)染后12h活性最強(qiáng)。 結(jié)論: (1)成功構(gòu)建了pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表達(dá)載體; (2) VacA蛋白瞬時(shí)高表達(dá)上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、NO和ROS; (3) VacA蛋白瞬時(shí)高表達(dá)誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞凋亡; (4) NF-κB可能參與調(diào)節(jié)VacA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞的分泌和凋亡。
[Abstract]:Aim: to construct pDsRed-Monomer-C1 / Vaca N-terminal eukaryotic expression vector and to study the effect of single virulence determinant of Helicobacter pylori (H. pylori) vacuole toxin on the secretion and apoptosis of THP-1 macrophages. And the role of nuclear factor kappa B (nuclear factor kappa BnNF- 魏 B in regulating the function of THP-1 macrophages induced by Vaca. Methods: the whole vacA gene was amplified by primer 5.0 primer, purified and inserted into eukaryotic expression vector pDsRed-Monomer-C1. The expression of Vaca protein in THP-1 macrophages was detected by Western-blot after restriction endonuclease digestion and sequencing. Electron microscopy and neutral red uptake assay were used to detect the level of no in the supernatant of macrophages. Fluorescence probe DCFH-DA was used to detect the ros of culture supernatant; flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells; and gel block assay (electrophoretic mobility gel shift assay) was used to detect the nuclear translocation of NF- 魏 B. Results: (1) double enzyme digestion and sequencing showed that the eukaryotic expression vector pDsRed-Monomer-C1 / vacAwas successfully constructed. The fluorescence of Vaca and red fluorescent protein expressed in the recombinant plasmid group was diffusely distributed in the cells. The results of Western-blot analysis showed that there was an immunoreactive band in the recombinant plasmid transfection group, and the fusion protein between Vaca and red fluorescent protein was expressed in the recombinant plasmid group, and the results of Western-blot analysis showed that there was an immunoreactive band in the transfected group. However, no immunoreactive bands were found in the empty plasmid transfection group and THP-1 macrophage group. (3) when the recombinant plasmid was transfected into THP-1 macrophage for 24 h, vacuoles of varying size were found in some cells. Neutral red uptake test showed that the uptake of neutral red increased significantly in the recombinant plasmid group at 6 h after transfection. The absorbance of the recombinant plasmid group reached the highest at 24 h after transfection, (4) at 6 h after transfection, the content of TNF- 偽 and IL-1 尾 in the supernatant of the recombinant plasmid group was significantly higher than that in the negative control group (P 0.05), and the content of TNF- 偽 and IL-1 尾 in the culture supernatant of the recombinant plasmid group was significantly higher than that in the negative control group (P0.05). (5) at 6 h or 12 h after transfection, the NON-Ros content in the supernatant of the recombinant plasmid group was significantly higher than that in the negative control group (P0.05), and reached the peak at 24 h after transfection; (6) at 16 h after transfection, NON-Ros content in the culture supernatant of the recombinant plasmid group was significantly higher than that in the negative control group (P0.05). The apoptosis rate of the recombinant plasmid group was significantly higher than that of the control group. Compared with the negative control group, there was a significant difference in the secretion of IL-1 尾 -TNF- 偽 and the apoptosis rate of the cells in the recombinant plasmid group (P0. 05); (7) and the specific inhibitor of NF- 魏 B (PDTC). Compared with the recombinant plasmid group, there was a significant difference (P0. 05); (8) EMSA assay showed that there was activated NF- 魏 B in the nucleus 3 h after transfection, and the activity of NF- 魏 B was the highest at 12 h after transfection. Conclusion: (1) pDsRed-Monomer-C1 / Vaca N-terminal eukaryotic expression vector was successfully constructed; (2) Vaca protein transient overexpression up-regulated the secretion of IL-1 尾 -TNF- 偽 no and ROSby THP-1 macrophages; (3) transient overexpression of VacA protein induced THP-1 expression. (4) NF- 魏 B may be involved in regulating the secretion and apoptosis of THP-1 macrophages induced by VacA.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2077280