本文選題：嚴重急性呼吸窘迫綜合征 + SARS冠狀病毒　； 參考：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)是由SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起的急性呼吸道傳染病。SARS傳播速度快、范圍廣、死亡率高,被稱為21世紀初最烈性的傳染病之一。SARS是由冠狀病毒家族的新成員-SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起,它既不是任何一種已知冠狀病毒的突變體,也不是已知冠狀病毒的重組體,是一種未知的冠狀病毒。該病病死率較高,尤其是65歲以上的老人可超過50%。SARS病毒作為一種新的冠狀病毒,其毒力遠遠超過其它已知的家族成員,目前尚無有效治療SARS的抗病毒藥物。人們普遍認為,研制一種安全有效的疫苗、開展人群免疫預(yù)防是阻止SARS再次流行最有效的方式。目前,已出現(xiàn)多種有發(fā)展前景的SARS-CoV疫苗形式,包括滅活病毒疫苗、基于SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白制備的DNA疫苗、活病毒載體疫苗等,表位疫苗是近年來新近發(fā)展起來的疫苗形式,安全性好,誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)針對性強。在我們的研究中,利用SARS-CoV Spike蛋白來源B細胞表位多肽及其產(chǎn)生的單克隆抗體在SARS-CoV感染細胞及體內(nèi)的過程中進行作用,對其作用效應(yīng)加以描述,同時對其作用機制加以探討,以期對SARS-CoV疫苗的研制工作提供有力的科學(xué)依據(jù)。 本研究中,我們首先在體外利用SARS-CoV Spike蛋白來源的四種B細胞表位多肽所產(chǎn)生的單克隆抗體在SARS-CoV感染Vero-E6細胞時進行作用,在篩選得到對病毒感染有中和作用抗體的同時,發(fā)現(xiàn)其中由S(597-625)多肽所制備的單克隆抗體S(597-625)43-3-14在病毒感染的過程中表現(xiàn)出隨抗體濃度增加而細胞受感染增強的現(xiàn)象。隨后我們對四種多肽進行不同組合,先后免疫了h-ACE2轉(zhuǎn)基因C57小鼠及恒河猴,經(jīng)檢測動物體內(nèi)特異性抗體達到穩(wěn)定水平后,進行SARS-CoV感染,分別于攻毒后2天與6天時間點安樂動物,觀察SARS-CoV作用靶器官肺組織的病理學(xué)變化及肺組織內(nèi)SARS-CoV載量,發(fā)現(xiàn)仍然是由S(597-625)多肽免疫的C57小鼠或恒河猴攻毒后在肺組織病理學(xué)改變上表現(xiàn)出嚴重的肺間質(zhì)性肺炎癥狀,病毒載量較對照組及其它免疫組增加。根據(jù)該實驗結(jié)果,我們又設(shè)計應(yīng)用高、低兩組濃度的S(597-625)43-3-14抗體靜脈注射于恒河猴體內(nèi),攻毒后仍選擇相同的時間點安樂恒河猴觀察病理學(xué)變化及肺組織的SARS-CoV載量,發(fā)現(xiàn)肺組織病理性損傷程度及病毒載量隨抗體濃度的升高而增加,說明S(597-625)43-3-14抗體在體外及體內(nèi)都可以增強SARS-CoV的感染。 本研究提示,在病毒感染過程中,可能存在一種通過抗體介導(dǎo)的獨立于Fc片段受體之外的非經(jīng)典ADE機制,當體內(nèi)已經(jīng)存在抗體或抗體結(jié)合力較低的情況下,這種ADE現(xiàn)象可以減弱、平衡掉其它中和抗體的作用甚至增強病毒的感染。盡管ADE的作用機制未被完全闡明,但是這種作用可被認為是研發(fā)預(yù)防各種感染的疫苗的一個最大障礙,而我們的研究將為SARS-CoV疫苗的研究及評價提供嚴謹有力的科學(xué)依據(jù)。 手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是以手掌、腳掌、口腔黏膜上發(fā)生水皰為特征的一種病毒性皮膚病,其病原體以柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CoxAl6)和人腸道病毒71型(human enterovirus 71, EV71)最為常見,�？刹《竞推渌恍┠c道病毒亦可致病。疾病進程為自限性,一般預(yù)后良好,少數(shù)病例可引發(fā)心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等嚴重并發(fā)癥甚至死亡。我國手足口病感染流行的全局性情況、病毒流行株的地區(qū)分布及變異性等都還有待進一步查明。2000-2005年,金奇等連續(xù)6年對深圳的手足口病流行情況進行監(jiān)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),2／3的病例是由CAl6病毒感染引起,1／3由EV71病毒感染導(dǎo)致。而2007年在山東局部流行的手足口病70%的病例是EV71病毒感染,CoxA16病毒感染只占總數(shù)的20%左右 全國今年已報告手足口病115618例,死亡50例。衛(wèi)生部新聞辦公室主任鄧海華指出,2009年3月全國通過傳染病網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)報告的手足口病病例是54713例,死亡31例。從今年年初到4月7號,網(wǎng)絡(luò)直報顯示,全國累計報告手足口病例115618例,其中重癥773例,死亡50例。 EV71病毒感染多呈隱性,顯性表現(xiàn)中,一般病例感染后進入HFMD/皰疹性咽峽炎階段,在原發(fā)病的基礎(chǔ)上,少數(shù)患者可累及神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。神經(jīng)源性肺水腫(neurogenic pul-monary edema, NPE)病死率高,是EV71病毒感染的重要并發(fā)癥和主要死因,也是本次阜陽市疫情中部分重癥患兒的主要死因,表現(xiàn)為起病第1～3天內(nèi)突然發(fā)生心動過速、呼吸困難、紫紺和休克，，胸片顯示雙側(cè)對稱性非心源性肺水腫,90%病例于發(fā)病后12h內(nèi)死亡[66],其嚴重性值得關(guān)注。 手足口病嚴重影響青少年兒童的身心健康,除要加強人群本身的健康狀況,提高自身免疫力,以有效抵御病毒的侵襲外,啟動EV71病毒疫苗的研制工作將成為手.足口病防治的重中之重。 我們利用安徽阜陽來源的病毒,作為疫苗制備的模版,根據(jù)NCBI已測序的EV71毒株-EU701832序列,將病毒的2193個氨基酸依次分割成含100～150個氨基酸的肽段進行表達。表達后的肽段作為抗原進行免疫學(xué)觀察,并對抗原刺激機體產(chǎn)生的抗體進行免疫學(xué)檢測及細胞保護性實驗。結(jié)果表明1#,5#,6#,7#,10#,13#,14#,18#,19#,20#抗原效果最佳,可以作為下一步動物保護性實驗候選疫苗。其中1#抗原屬于VP4蛋白,5#、6#抗原屬于VP3蛋白,7#抗原屬于VP1蛋白,10#抗原屬于2A蛋白,13#、14#抗原屬于2C蛋白、18#抗原屬于3C蛋白,19#、20#屬于3D蛋白。我們決定應(yīng)用1#,5#,6#,7#,10#,13#,14#,18#,19#,20#10個抗原,作為疫苗組合的基礎(chǔ)單位,進行三三融合,增加抗原的免疫效應(yīng)。 綜上,我們的工作為接下來進行的抗原肽段動物保護性實驗及今后的EV71病毒疫苗制備及鑒定工作打下堅實的理論基礎(chǔ),提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。
[Abstract]:Severe acute respiratory syndrome ( SARS ) is an acute respiratory disease caused by SARS - CoV . SARS is one of the most virulent infectious diseases in the early 21st century .



In this study , the monoclonal antibody produced by four B - cell epitopes of SARS - CoV spike protein was firstly used to infect Vero - E6 cells infected with SARS - CoV . The results showed that the monoclonal antibody S ( 597 - 625 ) 43 - 3 - 14 prepared by S ( 597 - 625 ) polypeptide was infected by infection .



This study suggests that , in the course of viral infection , there may be a non - classical ADE mechanism mediated by an antibody independent of the Fc fragment receptor , which may attenuate , balance , or even enhance the infection of the virus when an antibody or antibody binding force has been present in the body . Although the mechanism of action of ADE is not fully elucidated , this effect may be considered to be a major obstacle to the development of vaccines for the prevention of various infections , and our study will provide a rigorous scientific basis for the research and evaluation of SARS - CoV vaccines .



Hand , foot and mouth disease ( HFMD ) is a kind of viral skin disease characterized by the occurrence of blisters on the palms , soles and oral mucous membranes . The pathogen is the most common cause of infection of the coxievirus A16 ( CoxAl6 ) and human enteroviruses 71 ( EV71 ) . The disease progression is self - limited , the general prognosis is good , few cases can cause myocarditis , pulmonary edema , aseptic meningoencephalitis , etc .



According to Deng Haihua , director of public information office of the Ministry of Health , there were 5,713 cases of hand - and - mouth disease reported in the national reporting system of infectious diseases in March 2009 , and 31 cases died . From the beginning of the year to April 7 , the network reported that there were 115618 cases of hand - foot - mouth cases in China , including 773 cases and 50 deaths .



The EV71 virus infection is recessive and dominant , and the general case is infected with HFMD / HERPES . On the basis of the original pathogenesis , few patients may be involved in the nervous system , respiratory system and circulatory system . It is the main cause of EV71 virus infection . It is also the main cause of death of EV71 virus infection .



Hand - foot - mouth disease seriously affects the physical and mental health of young and young children . In addition to strengthening the health of the population and enhancing the immunity of the young children , the development of the EV71 virus vaccine will become a hand .



The results showed that 1 # , 5 # , 6 # , 7 # , 10 # , 13 # , 14 # , 18 # , 19 # and 20 # antigen were the best . and carrying out the three - three fusion to increase the immune effect of the antigen .



In conclusion , our work lays a solid theoretical foundation for the protection experiment of antigenic peptide section and the preparation and identification of EV71 virus vaccine in the future , and provides scientific experimental basis .
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1985252