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LPS與CD59單克隆抗體聯(lián)合激活補(bǔ)體抗腫瘤效應(yīng)的研究

發(fā)布時間:2021-04-01 19:13
  目的:國外報(bào)道在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中如腸道、卵巢、前列腺等已發(fā)現(xiàn)有CD59分子的過表達(dá),并證實(shí)其與腫瘤的失控性生長、惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立高效真核表達(dá)系統(tǒng),觀測人卵巢癌A2780細(xì)胞表面野生型CD59與突變型CD59分子的表達(dá)情況及其抗補(bǔ)體活性變化,推斷W40位點(diǎn)的生物學(xué)活性;并探討突變型CD59基因轉(zhuǎn)染與LPS聯(lián)合、以及LPS與CD59單克隆抗體聯(lián)合激活補(bǔ)體的抗腫瘤效應(yīng)。 方法:利用大腸桿菌JM109擴(kuò)增突變型CD59質(zhì)粒和野生型CD59質(zhì)粒,并用陽離子脂質(zhì)體(Lipfectine)將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入人卵巢癌A2780細(xì)胞,G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆。并用RT-PCR、酶免疫染色、熒光免疫染色、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)在mRNA水平和蛋白水平鑒定CD59突變基因和野生型基因的轉(zhuǎn)染成功。通過MTT法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及LDH乳酸脫氫酶釋放法觀察突變型CD59和野生型CD59抗補(bǔ)體能力的改變,以及CD59mAb與LPS聯(lián)合作用激活補(bǔ)體抗腫瘤效應(yīng)。 結(jié)果:通過RT-PCR、酶免疫染色、熒光免疫染色、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)鑒定說明建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型和突變型CD59的A2780細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示與野生型CD59相比,突變型CD59失去對補(bǔ)體的抑制功能,與對照組未轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞無顯著差別;在5 mg/L LPS單獨(dú)作用30 min后,MTT檢測對轉(zhuǎn)染野生型CD59,突變型CD59及未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率分別為(26.9±2.95)%、(36.3±4.87)%、(29.6±3.16)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LDH釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示對突變型CD59轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞,其補(bǔ)體殺傷率為65.13±9.77明顯高于野生型CD59轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);與CD59mAb、LPS的單獨(dú)作用組相比,兩者聯(lián)合作用在5mg/L和10mg/L時,補(bǔ)體的細(xì)胞殺傷率均明顯高于單獨(dú)作用組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)論:CD59的W40位點(diǎn)對其抗補(bǔ)體活性具有重要作用,封閉該位點(diǎn)能夠提高補(bǔ)體溶細(xì)胞作用,并有助于LPS發(fā)揮抑制瘤細(xì)胞增殖活性;CD59mAb與LPS較低劑量聯(lián)合即可明顯激活補(bǔ)體對人卵巢癌A2780細(xì)胞的殺傷活性,為高表達(dá)CD59的腫瘤治療提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】:青島大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2009
【分類號】:R730.5;R392
文章目錄
摘要
ABSTRACT
引言
技術(shù)路線
第一章 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 主要儀器設(shè)備
        1.1.2 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株
        1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
    1.2 方法
        1.2.1 突變型和野生型CD59重組質(zhì)粒的擴(kuò)增和鑒定
        1.2.2 A2780細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
        1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性克隆的篩選
        1.2.4 兔抗人CD59多抗的制備
        1.2.5 CD59分子的生物學(xué)活性檢測
第二章 結(jié)果
    2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞的篩選和鑒定
        2.2.1 免疫熒光檢測
        2.2.2 免疫酶法檢測
        2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)
        2.2.4 Western-blot
        2.2.5 RT-PCR
    2.3 MTT結(jié)果
    2.4 LDH結(jié)果
第三章 討論
    3.1 CD59蛋白和突變型CD59蛋白的真核表達(dá)
    3.2 CD59的生物學(xué)功能和W40位點(diǎn)活性研究
    3.3 LPS與CD59mAb的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
碩士研究生期間第一作者發(fā)表的文章
附錄
    附錄1 試劑的配制
    附錄2 CD59 cDNA序列
致謝
 

【參考文獻(xiàn)】

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1 秦誠;蔡小勇;;補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55及CD59在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展[J];癌癥;2006年11期

2 韓根成,白云,王更銀,姜曼,朱錫華;CD 59在sM AC誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞增殖效應(yīng)中的作用[J];免疫學(xué)雜志;1999年04期

3 郭林,白云;GPI錨固蛋白與T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];免疫學(xué)雜志;2000年S1期

4 辛云碧,陳松華,歸綏琪,葛錫銳;它莫西芬對絨毛膜癌細(xì)胞株JAR補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響[J];上海免疫學(xué)雜志;2003年01期

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6 靖學(xué)芳;LPS和抗LPS治療的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2004年02期

7 程穎;高美華;;利用噬菌體肽庫篩選與人CD59特異性結(jié)合的短肽[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年02期



本文編號:1932558

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