目的:國外報(bào)道在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中如腸道、卵巢、前列腺等已發(fā)現(xiàn)有CD59分子的過表達(dá),并證實(shí)其與腫瘤的失控性生長、惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立高效真核表達(dá)系統(tǒng),觀測人卵巢癌A2780細(xì)胞表面野生型CD59與突變型CD59分子的表達(dá)情況及其抗補(bǔ)體活性變化,推斷W40位點(diǎn)的生物學(xué)活性;并探討突變型CD59基因轉(zhuǎn)染與LPS聯(lián)合、以及LPS與CD59單克隆抗體聯(lián)合激活補(bǔ)體的抗腫瘤效應(yīng)。 方法:利用大腸桿菌JM109擴(kuò)增突變型CD59質(zhì)粒和野生型CD59質(zhì)粒,并用陽離子脂質(zhì)體(Lipfectine)將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入人卵巢癌A2780細(xì)胞,G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆。并用RT-PCR、酶免疫染色、熒光免疫染色、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)在mRNA水平和蛋白水平鑒定CD59突變基因和野生型基因的轉(zhuǎn)染成功。通過MTT法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及LDH乳酸脫氫酶釋放法觀察突變型CD59和野生型CD59抗補(bǔ)體能力的改變,以及CD59mAb與LPS聯(lián)合作用激活補(bǔ)體抗腫瘤效應(yīng)。 結(jié)果:通過RT-PCR、酶免疫染色、熒光免疫染色、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)鑒定說明建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型和突變型CD59的A2780細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示與野生型CD59相比,突變型CD59失去對補(bǔ)體的抑制功能,與對照組未轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞無顯著差別;在5 mg/L LPS單獨(dú)作用30 min后,MTT檢測對轉(zhuǎn)染野生型CD59,突變型CD59及未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率分別為(26.9±2.95)%、(36.3±4.87)%、(29.6±3.16)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LDH釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示對突變型CD59轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞,其補(bǔ)體殺傷率為65.13±9.77明顯高于野生型CD59轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);與CD59mAb、LPS的單獨(dú)作用組相比,兩者聯(lián)合作用在5mg/L和10mg/L時,補(bǔ)體的細(xì)胞殺傷率均明顯高于單獨(dú)作用組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論:CD59的W40位點(diǎn)對其抗補(bǔ)體活性具有重要作用,封閉該位點(diǎn)能夠提高補(bǔ)體溶細(xì)胞作用,并有助于LPS發(fā)揮抑制瘤細(xì)胞增殖活性;CD59mAb與LPS較低劑量聯(lián)合即可明顯激活補(bǔ)體對人卵巢癌A2780細(xì)胞的殺傷活性,為高表達(dá)CD59的腫瘤治療提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R730.5;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1932558