金黃色葡萄球菌腸毒素B作為免疫佐劑的研究
發(fā)布時間：2021-08-08 16:47
動物疫病的頻發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成了困擾,尤其是病毒性疫病缺少有效的治療,積極的免疫預防是不可或缺的。目前畜禽用的疫苗有各種類型,包括很多新型疫苗,如亞單位疫苗,重組疫苗和合成多肽疫苗等,但此類疫苗免疫原性較弱,單獨免疫難以達到有效的免疫效果,開發(fā)活性高而副作用低的新型免疫佐劑的研究日益迫切。 佐劑是指與抗原同時或預先應用,能增強機體針對抗原的免疫應答能力,提高免疫效果的物質(zhì)；目前研究的佐劑有上百種,其功能主要是增強機體應答、減少抗原接種劑量和接種次數(shù)、促進疫苗在免疫應答能力弱的群體中的免疫效果、加快免疫應答的速度和延長持續(xù)時間等,具備這種免疫功能的物質(zhì)都有成為免疫佐劑的潛力。 金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素B(SEB)是一種具有超抗原性質(zhì)的外毒素,具有MHC結(jié)合的非限制性；可激活外周血T細胞,調(diào)節(jié)NK細胞以及刺激淋巴細胞產(chǎn)生TFN-α和活化Thl細胞等功效。能夠刺激T細胞活性,提高機體免疫水平,尤其是細胞免疫水平。SEB非特異性地激活免疫細胞,引起眾多細胞因子產(chǎn)生的能力使其具備成為免疫佐劑的潛力。本課題的研究內(nèi)容主要包括： 根據(jù)SEB DNA序列設(shè)計合成了一對特異性引物,以金黃色葡萄球菌S6株基因組為模板,采用PCR方法擴增了SEB基因并克隆到pMD18-T載體,對所得到的重組質(zhì)粒進行酶切分析及序列測定,結(jié)果表明該基因全長720 bp,與已報道的PM36株序列同源性達100%。構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pKG-SEB和pET-28a-SEB,并分別在大腸桿菌中進行了高效表達,對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果分別出現(xiàn)了與預期分子量大小一致的54 KD和28 KD的蛋白條帶,Western-blotting分析表明表達的融合蛋白產(chǎn)物均具有良好的生物學活性,為今后進一步的研究奠定了堅實基礎(chǔ)。 將含有禽流感病毒H5亞型HA1的原核表達載體pKG-HA1在大腸桿菌中進行誘導表達,對表達產(chǎn)物上清及包涵體進行SDS-PAGE電泳分析,出現(xiàn)了與預期融合蛋白GST-HA1分子量大小一致的蛋白條帶約60 KD,且目的蛋白多以包涵體形式存在。 本實驗采用幾個濃度的重組SEB和標準SEB分別與AIV H9/NDV二聯(lián)滅活苗免疫兩周齡艾維因肉雞,通過對抗體滴度及淋巴細胞活性的測定反映SEB的免疫增強效果。實驗數(shù)據(jù)顯示重組SEB按5μg/只的劑量免疫肉雞時有較好的免疫增強效果；在免疫前期SEB免疫組較疫苗對照組抗體效價增長快,7d和14 d時,重組SEB中劑量組抗體效價比疫苗對照組高約2.0個滴度,到28 d時,仍比疫苗對照組抗體效價高約1.5個滴度,統(tǒng)計分析表明SEB免疫組的效價顯著高于疫苗對照組(P0.05),重組SEB中劑量組與其他SEB免疫組的效價均有顯著差異(P0.05)；淋巴細胞活性在免疫后15d達最高,重組SEB中劑量組比疫苗對照組高約2.5倍,統(tǒng)計分析差異顯著(P0.05),到25 d時差異減小但仍顯著。 將重組SEB按5μg/只的劑量分別與AIV H5滅活苗、重組蛋白GST-HA1免疫雛雞,同時設(shè)各對照組,實驗數(shù)據(jù)顯示重組SEB對滅活苗及重組亞單位苗的免疫都起到了增強效果,其中疫苗和SEB免疫組的抗體效價顯著高于疫苗免疫組和疫苗空載免疫組(P0.05),HA1和SEB免疫組的抗體效價也顯著高于HA1免疫組(P0.05)。 SEB作為一種超抗原具有超強的免疫激活能力,本實驗通過三次動物實驗優(yōu)化了SEB較好發(fā)揮免疫效果時的免疫劑量,實驗表明適當劑量的SEB可增強機體對疫苗的免疫應答,無論是體液免疫還是細胞免疫。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392
本文編號：1840272
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392
文章目錄
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
1 疫苗免疫的現(xiàn)狀
1.1 滅活苗
1.2 弱毒苗
1.3 亞單位疫苗
1.4 合成肽疫苗
1.5 基因工程載體疫苗
1.6 基因工程缺失苗
1.7 抗獨特性抗體疫苗
1.8 基因疫苗
1.9 轉(zhuǎn)基因植物疫苗
2 佐劑的研究進展
2.1 鋁鹽佐劑
2.2 弗氏佐劑
2.3 免疫刺激復合物(ISCOMs)
2.4 脂質(zhì)體
2.5 寡脫氧核苷酸(oligodeoxyneucleotide,ODN)
2.6 細胞因子
2.7 細菌毒素
2.8 蜂膠
3 超抗原及金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的研究進展
3.1 超抗原的研究
3.1.1 超抗原的定義和發(fā)現(xiàn)
3.1.2 超抗原的特性
3.1.3 超抗原的免疫效應
3.2 SEB的特性
3.2.1 SEB的生物學特性
3.2.2 SEB的超抗原性
3.2.3 SEB的免疫學功能
3.3 SEB的臨床應用
第二章 金黃色葡萄球菌腸毒素B、禽流感病毒H5HA1的克隆與表達
1 研究的目的和意義
2 材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.1 載體及菌株
2.1.2 酶及主要試劑
2.1.3 標準抗原及陽性血清
2.2 主要溶液的配制
2.2.1 抗生素類
2.2.2 細菌培養(yǎng)基
2.2.3 DNA的瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液
2.2.4 質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液
2.2.5 SDS-PAGE相關(guān)溶液
2.2.6 Western-blotting相關(guān)溶液
2.2.7 表達提取純化表達蛋白的相關(guān)溶液
2.2.8 其它試劑
2.3 試驗方法
2.3.1 引物設(shè)計
2.3.2 目的片段的擴增
2.3.3 PCR產(chǎn)物的回收與純化
2.3.4 PCR產(chǎn)物的克隆
2.3.5 感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
2.3.6 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
2.3.7 質(zhì)粒的制備(堿裂解法)
2.3.8 序列測定
2.3.9 DNA重組技術(shù)(DNA酶切、連接)
2.3.10 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定
2.3.11 原核表達載體的構(gòu)建
2.3.12 大腸桿菌BL21(DE3)的誘導表達
2.3.13 重組蛋白的表達提取
2.3.14 重組蛋白的純化
2.3.15 包涵體的制備
2.3.16 包涵體的純化與復性
2.3.17 蛋白濃度的確定
2.3.18 表達蛋白的SDS-PAGE分析和Western-blotting鑒定
3 結(jié)果與分析
3.1 SEB的PCR擴增
3.2 SEB基因克隆和鑒定
3.3 SEB基因的序列測定與分析
3.4 重組質(zhì)粒pKG-SEB和pET-28a-SEB的酶切鑒定
3.5 重組蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果
3.6 重組蛋白表達產(chǎn)物的Western-blotting鑒定結(jié)果
4 討論
4.1 目的蛋白的選擇
4.2 目的基因的克隆
4.3 融合蛋白表達產(chǎn)物的處理
4.4 融合蛋白表達產(chǎn)物的純化
5 結(jié)論
第三章 金黃色葡萄球菌腸毒素B作為免疫佐劑的研究
1 研究目的和意義
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 實驗動物及抗原
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要溶液
2.1.4 主要實驗器材
2.2 試驗方法
2.2.1 免疫原的準備
2.2.2 動物試驗
2.2.3 MTT法測定淋巴細胞增值實驗的步驟
2.2.4 血凝抑制實驗檢測血清抗體實驗步驟
3 結(jié)果與分析
3.1 SEB佐劑效應試驗結(jié)果
3.2 重組SEB較優(yōu)劑量選擇試驗結(jié)果
3.3 重組SEB增強亞單位疫苗免疫效果試驗結(jié)果
4 討論
4.1 SEB劑量的確定
4.2 免疫指標的選擇
4.3 淋巴細胞活性測定方法的選擇
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
【參考文獻】
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本文編號：1840272
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