動(dòng)物疫病的頻發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成了困擾,尤其是病毒性疫病缺少有效的治療,積極的免疫預(yù)防是不可或缺的。目前畜禽用的疫苗有各種類型,包括很多新型疫苗,如亞單位疫苗,重組疫苗和合成多肽疫苗等,但此類疫苗免疫原性較弱,單獨(dú)免疫難以達(dá)到有效的免疫效果,開發(fā)活性高而副作用低的新型免疫佐劑的研究日益迫切。 佐劑是指與抗原同時(shí)或預(yù)先應(yīng)用,能增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力,提高免疫效果的物質(zhì)；目前研究的佐劑有上百種,其功能主要是增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)答、減少抗原接種劑量和接種次數(shù)、促進(jìn)疫苗在免疫應(yīng)答能力弱的群體中的免疫效果、加快免疫應(yīng)答的速度和延長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間等,具備這種免疫功能的物質(zhì)都有成為免疫佐劑的潛力。 金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素B(SEB)是一種具有超抗原性質(zhì)的外毒素,具有MHC結(jié)合的非限制性；可激活外周血T細(xì)胞,調(diào)節(jié)NK細(xì)胞以及刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TFN-α和活化Thl細(xì)胞等功效。能夠刺激T細(xì)胞活性,提高機(jī)體免疫水平,尤其是細(xì)胞免疫水平。SEB非特異性地激活免疫細(xì)胞,引起眾多細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力使其具備成為免疫佐劑的潛力。本課題的研究?jī)?nèi)容主要包括： 根據(jù)SEB DNA序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物,以金黃色葡萄球菌S6株基因組為模板,采用PCR方法擴(kuò)增了SEB基因并克隆到pMD18-T載體,對(duì)所得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析及序列測(cè)定,結(jié)果表明該基因全長(zhǎng)720 bp,與已報(bào)道的PM36株序列同源性達(dá)100%。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pKG-SEB和pET-28a-SEB,并分別在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果分別出現(xiàn)了與預(yù)期分子量大小一致的54 KD和28 KD的蛋白條帶,Western-blotting分析表明表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)物均具有良好的生物學(xué)活性,為今后進(jìn)一步的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 將含有禽流感病毒H5亞型HA1的原核表達(dá)載體pKG-HA1在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物上清及包涵體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,出現(xiàn)了與預(yù)期融合蛋白GST-HA1分子量大小一致的蛋白條帶約60 KD,且目的蛋白多以包涵體形式存在。 本實(shí)驗(yàn)采用幾個(gè)濃度的重組SEB和標(biāo)準(zhǔn)SEB分別與AIV H9/NDV二聯(lián)滅活苗免疫兩周齡艾維因肉雞,通過對(duì)抗體滴度及淋巴細(xì)胞活性的測(cè)定反映SEB的免疫增強(qiáng)效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示重組SEB按5μg/只的劑量免疫肉雞時(shí)有較好的免疫增強(qiáng)效果；在免疫前期SEB免疫組較疫苗對(duì)照組抗體效價(jià)增長(zhǎng)快,7d和14 d時(shí),重組SEB中劑量組抗體效價(jià)比疫苗對(duì)照組高約2.0個(gè)滴度,到28 d時(shí),仍比疫苗對(duì)照組抗體效價(jià)高約1.5個(gè)滴度,統(tǒng)計(jì)分析表明SEB免疫組的效價(jià)顯著高于疫苗對(duì)照組(P0.05),重組SEB中劑量組與其他SEB免疫組的效價(jià)均有顯著差異(P0.05)；淋巴細(xì)胞活性在免疫后15d達(dá)最高,重組SEB中劑量組比疫苗對(duì)照組高約2.5倍,統(tǒng)計(jì)分析差異顯著(P0.05),到25 d時(shí)差異減小但仍顯著。 將重組SEB按5μg/只的劑量分別與AIV H5滅活苗、重組蛋白GST-HA1免疫雛雞,同時(shí)設(shè)各對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示重組SEB對(duì)滅活苗及重組亞單位苗的免疫都起到了增強(qiáng)效果,其中疫苗和SEB免疫組的抗體效價(jià)顯著高于疫苗免疫組和疫苗空載免疫組(P0.05),HA1和SEB免疫組的抗體效價(jià)也顯著高于HA1免疫組(P0.05)。 SEB作為一種超抗原具有超強(qiáng)的免疫激活能力,本實(shí)驗(yàn)通過三次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了SEB較好發(fā)揮免疫效果時(shí)的免疫劑量,實(shí)驗(yàn)表明適當(dāng)劑量的SEB可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答,無論是體液免疫還是細(xì)胞免疫。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 李晉濤,吳玉章;轉(zhuǎn)基因植物疫苗研究進(jìn)展[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年S1期

2 孫永科,王云峰,楊增岐,童光志;禽痘病毒分子生物學(xué)特性及在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2004年05期

3 周紅蕾;李春玲;王貴平;侯加法;;脂質(zhì)體作為疫苗免疫佐劑的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年02期

4 姜建波;提金鳳;李志杰;;新型疫苗研究概況[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年01期

5 徐冰;粘膜途徑疫苗接種的免疫調(diào)節(jié)劑和送遞系統(tǒng)(上)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);2002年01期

6 郭淑玲;新型免疫佐劑及其作用機(jī)理[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);1995年06期

7 黃常新,王青青;超抗原的免疫功能及其作用機(jī)制研究現(xiàn)狀[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2003年06期

8 王小紅;謝筆鈞;史賢明;;金黃色葡萄球菌B型腸毒素的構(gòu)象研究[J];現(xiàn)代食品科技;2008年04期

9 沈詠舟,謝三星,魏建忠,曾明華;免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑的研究近況[J];吉林畜牧獸醫(yī);1996年04期

10 金璐娟,金宇龍,王全民;動(dòng)物疫苗的種類及其評(píng)價(jià)[J];吉林畜牧獸醫(yī);2003年07期

本文編號(hào)：1840272