本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)性腦卒中的蛋白組學(xué)研究

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【摘要】：[背景]腦卒中在中國或者西方國家也同樣是其中一種致命率及致殘率高的疾病。盡管研究人員及社會已付出了足夠的重視,但目前仍沒有顯著治愈卒中病人的治療方法。利用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療缺血性腦卒中的研究無論在動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究都已經(jīng)具有一些積極性成果。MSCs移植入缺血性腦卒中的小鼠動物模型后,能顯著減少其梗死體積并可改善其神經(jīng)功能評分。然而MSCs治療缺血性卒中所產(chǎn)生療效的機(jī)制尚不清楚。人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)是一種來源于人類臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞,hUC-MSCs與胚胎干細(xì)胞(ESC)有密切的關(guān)系,在個(gè)體發(fā)育和增殖的速度都較快于成人的干細(xì)胞。在我們既往工作中發(fā)現(xiàn),在進(jìn)行大腦中動脈閉塞(MCAO)后的小鼠在缺血再灌注的半小時(shí)內(nèi)給予靜脈輸注hUC-MSCs,可以顯著改善模型小鼠的神經(jīng)功能缺損程度及減少腦梗死的體積。此外,我們還發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs能夠抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平和增加抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平,而這些因子表達(dá)水平的改變能被TGF-β的中和抗體所部分抑制。故此我們推測hUC-MSCs或許能通過TGF-p,逆轉(zhuǎn)由原始CD4+分化成Th17/Treg和發(fā)揮調(diào)節(jié)外周免疫反應(yīng)的作用。然而其產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。[目的]我們使用iTRAQ(同位素標(biāo)記相對和絕對定量),這是在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中使用的一種定量化的工具,來分析腦卒中組、對照組以及hUC-MSCs治療組之間各組的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,揭示hUC-MSCs治療缺血性卒中的可能作用機(jī)制。[方法]用12只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成四個(gè)組實(shí)驗(yàn)組：對照組、MCAO-24h組、MCAO-48h組及經(jīng)MSCs處理后的MCAO-48h組,制備MCAO模型90 min后,均予以再灌注處理：再灌注后30min分別通過尾靜脈途徑緩慢注射hUC-MSCs 4×106/ml×0.5ml或等體積NS,均在缺血再灌注后24h、48h分別分離出皮層梗死灶周圍區(qū)域的腦組織：1.對樣本用iTRAQ和二維液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜分析(2D-nanoLC-MS/MS),得每個(gè)樣本此蛋白片段的相對含量并將質(zhì)譜結(jié)果翻譯成為蛋白相對含量數(shù)據(jù)并按4個(gè)對比：MCAO-24h與對照組、MCAO-48h與對照組、MCAO-48h與MCAO-24h及經(jīng)MSCs處理后的MCAO-48h與MCAO-48h其中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化進(jìn)行相互比較發(fā)現(xiàn)差異蛋白;2.對差異蛋白進(jìn)行GO分析；3.差異蛋白與CD200-CD200R1、CCL21-CXCR網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析。4.分析轉(zhuǎn)錄因子(c-myb, Runx-1,Pu.1,Irf8,Hoxb8)與差異蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系性分析。5.我們把90只小鼠隨機(jī)分成對照組、MCAO組及MCAO+MSCs組,在MCAO 6h、12h、24h、 48h、72h、1W后從三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取5只小鼠進(jìn)行qPCR分析,同樣ELISA的分析是取自MCAO24h、48h、72h后從三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取5只小鼠,進(jìn)一步分析差異蛋白中Abca13、Grb2、Ptgds的mRNA和蛋白含量水平。[結(jié)果]1.共有16個(gè)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)；2.對表達(dá)差異的蛋白質(zhì)做了基因本體論的分析結(jié)果；3.表達(dá)差異的蛋白質(zhì)與CD200-CD200R1、CCL21-CXCR3網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)MCAO-24h與對照組的趨勢是幾乎與MCAO-48h與MCAO-24h組呈相反的；4.發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)差異的蛋白和轉(zhuǎn)錄因子之間的聯(lián)系性的關(guān)系是較復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。5.進(jìn)一步qPCR及ELISA核實(shí)后,Abcal3和Grb2蛋白的變化可能在hUC-MSC移植治療的缺血性卒中的過程中相對較為重要。[結(jié)論]本次的研究當(dāng)中,利用iTRAQ分析出在小鼠缺血性再灌注后及經(jīng)hUC-MSCs治療后具有蛋白水平差異變化的蛋白有16種,而且還能看出他們和一些轉(zhuǎn)錄因子或其他蛋白之間的復(fù)雜聯(lián)系性,同時(shí)驗(yàn)證了Abca13和Grb2的蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)了它們值得更要進(jìn)一步的關(guān)注和研究。實(shí)際上既往的有關(guān)缺血性卒中的研究中,這16種蛋白大多都未被涉及。我們希望本次的研究可以引起廣大研究人員對這些蛋白在腦卒中的作用加以重視,這或許可以幫助我們進(jìn)一步理解腦卒中發(fā)生以及加強(qiáng)對hUC-MSCs治療缺血性卒中的證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：卒中 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 蛋白質(zhì)組學(xué) iTRAQ
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 英文縮寫詞表13-14
• 第一章 蛋白質(zhì)組學(xué)在腦血管疾病中的研究及應(yīng)用的進(jìn)展14-36
• 1.前言14-15
• 2.蛋白組學(xué)的技術(shù)在神經(jīng)血管疾病中的應(yīng)用15-23
• 3.收獲、挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展方向23-25
• 4.結(jié)語25-26
• 參考文獻(xiàn)26-36
• 第二章 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)性腦卒中的蛋白組學(xué)研究36-65
• 1. 前言36-37
• 2. 材料和方法37-42
• 3. 結(jié)果42-54
• 3.1 腦缺血后小鼠腦內(nèi)不同蛋白的表達(dá)水平42-44
• 3.2 基因本體論學(xué)(Gene Ontology)分析44-45
• 3.3 與CD200-CD200R1、CCL21-CXCR3網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析45-48
• 3.4 與轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系性48-52
• 3.5 進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白組學(xué)的結(jié)果52-54
• 4. 討論54-57
• 4.1 在缺血性卒中過程中出現(xiàn)表達(dá)水平差異的蛋白54-55
• 4.2 hUC-MSCs治療后出現(xiàn)表達(dá)水平差異的蛋白55-57
• 5. 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 作者簡介65-66
• 發(fā)表文章66-67
• 致謝67-68

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本文編號：990665