發(fā)布時間：2017-10-04 20:00

  本文關(guān)鍵詞：單核細胞趨化蛋白1誘導(dǎo)蛋白調(diào)節(jié)BV-2細胞的炎癥因子表達

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【摘要】：研究背景缺血性腦卒中、缺血缺氧性腦病、神經(jīng)退行性疾病如帕金森病(Parkinson's disease, PD)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和其他顱內(nèi)炎癥相關(guān)性疾病產(chǎn)生炎癥因子和抗炎癥因子,繼而調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥以及疾病的病理過程。有研究報道缺血性腦卒中后可誘發(fā)外周血的中性粒細胞、單核巨噬細胞浸潤以及小膠質(zhì)細胞激活、釋放炎癥因子,加重了神經(jīng)元、血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的損害,導(dǎo)致腦卒中后的神經(jīng)組織發(fā)生二次損傷,使神經(jīng)功能進一步惡化。另外,以中老年人高發(fā)病率為特點的PD、AD,是人類最常見的神經(jīng)退行性疾病,嚴(yán)重危害著人類健康,并且此類疾病發(fā)病原因及機制復(fù)雜,目前有遺傳學(xué)說、感染學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、神經(jīng)毒性學(xué)說等,迄今尚未被具體闡明,所以關(guān)于此類疾病的治療是長久以來醫(yī)學(xué)研究的一個難題。隨著免疫組織化學(xué)以及分子生物學(xué)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病患者的神經(jīng)組織中存在著局部炎癥反應(yīng),而小膠質(zhì)細胞激活后所表達產(chǎn)生的一系列炎癥因子已被證實是導(dǎo)致此類疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理機制之一。以上說明了小膠質(zhì)細胞和炎癥因子在顱內(nèi)疾病的發(fā)病機制中起著十分重要作用。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中主要的免疫細胞。當(dāng)神經(jīng)組織受到病原體、異物大分子等刺激時,小膠質(zhì)細胞可迅速由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)換為激活狀態(tài)繼而產(chǎn)生炎癥介質(zhì)介導(dǎo)顱內(nèi)免疫反應(yīng),協(xié)助清除細胞碎片、病原體微生物、異物大分子等,對維持CNS的平衡狀態(tài)具有獨特的作用。但激活小膠質(zhì)細胞具有雙刃劍的特點,一方面小膠質(zhì)細胞可通過釋放炎癥因子抵抗病原體及其他異物的損害；另一方面在特定的環(huán)境下,激活的小膠質(zhì)細胞釋放大量的一氧化氮(nitric oxide, NO)、前炎癥因子如白介素(interleukin,IL)-1/6/12、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)等具有神經(jīng)元毒性作用的炎癥介質(zhì)加重神經(jīng)組織損傷。因此,針對小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的作用環(huán)節(jié),可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥相關(guān)性疾病有效的治療靶點。單核細胞趨化蛋白1誘導(dǎo)蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein, MCPIP)又名ZC3H12A�；诖说鞍追肿泳哂泻怂醿�(nèi)切酶活性,后來又將其命名為調(diào)節(jié)性RNA酶-1 (regulatory RNase-1, Regnase-1)。該蛋白由具有RNA酶活性的PIN-類似結(jié)構(gòu)域、核定位序列、可結(jié)合RNA的CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)域和2個介導(dǎo)蛋白相互作用的脯氨酸富集區(qū)組成。MCPIP是一種新發(fā)現(xiàn)的CCCH型鋅指蛋白,目前研究已明確的CCCH型鋅指蛋白如Roquin、Tristetraprolin蛋白均參與RNA的代謝,尤其是炎癥因子的mRNA降解,對炎癥反應(yīng)具有負調(diào)節(jié)作用。由此推測,MCPIP在CNS中可能具有抑制炎癥反應(yīng)的特性。炎癥反應(yīng)是機體抵抗病原體的重要機制,分泌炎癥因子抵御病原體保護機體組織,同時炎癥過程也受到適當(dāng)?shù)囊种普{(diào)節(jié)以防止過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機體組織損傷。而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要機制之一,目前已有實驗研究闡明了MCPIP具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控炎癥反應(yīng)的生物功能,可直接降解炎癥相關(guān)因子的mRNA或抑制炎癥信號通路,在調(diào)控炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用,MCPIP也因而成為炎癥相關(guān)研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的熱點。MCPIP的PIN-類似結(jié)構(gòu)具有RNA酶活性,可直接降解多種編碼炎癥因子的mRNA分子如IL-1β,IL-6, IL-12p40等。除此之外,CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)域以及其上游的一個N末端保守序列(N-terminalconserved region, NCR)具有去泛素化活性,有研究表明MCPIP的去泛素化活性可抑制NF-κB和JNK信號通路,繼而下調(diào)炎癥因子的基因表達。因此,MCPIP是一個免疫負調(diào)節(jié)因子,可通過發(fā)揮RNA酶活性以及去泛素化活性抑制炎癥反應(yīng)。到目前為止關(guān)于MCPIP與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的國內(nèi)外研究很少,因此MCPIP是否對顱內(nèi)炎癥反應(yīng)的具有調(diào)控作用尚不清楚,但近幾年仍然有個別研究報道了MCPIP與CNS疾病的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)MCPIP參與了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或電針預(yù)刺激誘導(dǎo)的大腦缺血耐受效應(yīng),并發(fā)現(xiàn)敲除ZC3H12A基因的大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型小鼠表現(xiàn)出更大的缺血面積以及更高的炎癥因子表達。說明MCPIP在CNS中具有抑制顱內(nèi)炎癥的潛能,但仍需要更多的研究進一步闡明。MCPIP在包括T細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞被多種炎癥分子如LPS、IL-1β、TNF-α等誘導(dǎo)表達,而MCPIP又可負調(diào)節(jié)免疫細胞的生物功能,從而維持免疫穩(wěn)定和炎癥反應(yīng)平衡。近年來有研究發(fā)現(xiàn)MCPIP同樣在小膠質(zhì)細胞中被誘導(dǎo)表達,但在顱內(nèi)炎癥過程中小膠質(zhì)細胞表達的MCPIP是否負調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)尚不清楚。本研究組將以小膠質(zhì)細胞株BV-2細胞為研究對象,通過實驗探究LPS或糖氧剝奪／復(fù)糖復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation plus reoxygenation, OGD/R)是否能誘導(dǎo)BV-2細胞表達MCPIP,并通過功能缺失的方法探討MCPIP對BV-2細胞的炎癥抑制效應(yīng)；最后,探究LPS刺激下MCPIP對神經(jīng)元的潛在保護效應(yīng),從而評價MCPIP對顱內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用以及對神經(jīng)組織的保護作用。研究目的1.明確LPS或OGD/R干預(yù)下是否可誘導(dǎo)MCPIP在BV-2細胞中表達。2.在LPS刺激下,探究MCPIP被敲低后是否增加BV-2細胞炎癥因子表達并加重LPS誘導(dǎo)BV-2細胞的神經(jīng)元毒性。研究方法1.LPS刺激BV-2細胞誘導(dǎo)MCPIP表達小鼠小膠質(zhì)細胞株BV-2細胞用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清Fetal Bovine Serum, FBS)培養(yǎng),當(dāng)BV-2細胞生長密度約80%時,用LPS(1μg/ml)在不同時間點(4,8,12及24h)分別刺激細胞。另外用不同濃度LPS(0.1,0.3及1μg/ml)分別刺激BV-2細胞4h,每組獨立重復(fù)3次。最后用常規(guī)RT-PCR和Western blot方法分別檢測mRNA和蛋白表達水平,明確LPS刺激下BV-2細胞表達MCPIP的變化。2.建立BV-2細胞的體外缺氧再灌注模型用BV-2細胞進行OGD/R處理,模擬體外缺血再灌注狀態(tài)。將OGD與REOX不同時間點之間的組合,將BV-2細胞分成7組,OGDlh/R3h、OGDlh/R24h、 OGD2h/R3h、OGD2h/R24h、OGD4h/R3h、OGD4h/R24h及正常對照組,每組獨立重復(fù)3次。用Western blot方法明確不同OGD/R時間點組合誘導(dǎo)BV-2細胞表達MCPIP的表達變化。3.確立siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細胞的轉(zhuǎn)染時間將MCPIP特異性siRNA轉(zhuǎn)染到BV-2細胞中(siMCPIP組),錯義序列siRNA作為陰性對照(siControl組)。根據(jù)說明書操作說明將Lipofectamine 2000 (5 μl/ml)和siRNA(50pM)混合后加到細胞培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染。實驗分為2組,一組siRNA轉(zhuǎn)染細胞24h,另外一組siRNA轉(zhuǎn)染細胞48h,實驗獨立重復(fù)3次,采用常規(guī)RT-PCR及DNA凝膠電泳最后確認轉(zhuǎn)染效率,摸索轉(zhuǎn)染效率較好的轉(zhuǎn)染時間。4.檢測MCPIP敲低后BV-2細胞炎癥相關(guān)因子的表達變化實驗分為兩組,siMCPIP組以及siControl組。轉(zhuǎn)染后用相同濃度LPS(1 u g/ml)刺激BV-2細胞4h,提取總的RNA,逆轉(zhuǎn)錄后行熒光定量RT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, QRT-PCR),特異性擴增MCPIP以及炎癥因子IL-12b、IL-6、IL-1β、IL-23、即刻早期反應(yīng)蛋白3(immediate early response 3,IER3)、腫瘤壞死因子受體2 (tumor necrosis factor receptor2,TNFR2)、可誘導(dǎo)刺激分子(inducible costimulator, ICOS)的cDNA。實驗獨立重復(fù)3次,相對RNA表達量用2-△△Ct方法計算。5.檢測MCPIP低后BV-2細胞上清的對SH-SY5Y的神經(jīng)元毒性實驗分為兩組,siMCPIP組及siControl組。BV-2細胞完成轉(zhuǎn)染后,用LPS(0.1μg/ml)刺激細胞4h換新鮮DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h并收集細胞上清。將細胞上清與神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y細胞共孵育6h。3次獨立重復(fù)實驗,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法測量SH-SY5Y細胞的細胞存活率；用乳酸脫氫酶(dehydrogenase, LDH)釋放實驗測量SH-SY5Y細胞的死亡率。6.統(tǒng)計分析本研究全部數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,兩獨立樣本實驗方差齊的數(shù)據(jù)采用Student's t檢驗方法,方差不齊的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.常規(guī)RT-PCR以及Western blot結(jié)果表明,相同濃度的LPS(1μg/ml)分別刺激BV-2細胞4、8、12和12h,LPS刺激4h后MCPIP的mRNA表達即顯著增加并持續(xù)至24h(P0.01)。與此不同的是,MCPIP的蛋白表達水平也呈現(xiàn)時間依賴性,從4h開始緩慢增加并在12h到達表達高峰,但在LPS刺激24h后MCPIP蛋白表達明顯下降。另外,不同濃度的LPS (0.1、0.3、1μg/ml)刺激BV-2細胞均可明顯誘導(dǎo)MCPIP表達增高(P0.05)。2.不同OGD/R時間點組合的干預(yù)下能誘導(dǎo)BV-2細胞MCPIP蛋白表達增加。Western blot結(jié)果表明OGD2h/R3h、OGD2h/R24h兩組對BV-2細胞表達MCPIP蛋白的誘導(dǎo)能力較強。3.BV-2細胞轉(zhuǎn)染siRNA48h(P0.05)較24h(P0.05)能得到較好的敲低效率,siRNA轉(zhuǎn)染48h后QRT-PCR結(jié)果顯示MCPIP的敲低效率可達約60%。LPS刺激下,對siControl組,MCPIP敲低后會導(dǎo)致BV-2細胞的IL-6、IL-12b的mRNA表達增加(P0.05),卻顯著降低了立即早期反應(yīng)蛋白3(immediate earlyresponse 3, IER3)的mRNA表達(P0.05),其他的炎癥因子IL-1β、IL-23、 TNFR2、ICOS的mRNA表達變化較陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.LPS刺激BV-2細胞后收集細胞上清,然后將細胞上清與SH-SY5Y細胞共孵育后研究發(fā)現(xiàn),MCPIP敲低后BV-2細胞的細胞上清具有更大的神經(jīng)元毒性。對比siControl組,MCPIP敲低后的細胞上清與SH-SY5Y細胞共孵育,SH-SY5Y細胞存活率降低(P0.05)且細胞死亡率更高(P0.05)。結(jié)論1.本研究通過體外實驗驗證了小膠質(zhì)細胞株BV-2細胞可被LPS或OGD/R誘導(dǎo)表達MCPIP的表達,可為將來更進一步顱內(nèi)炎癥相關(guān)性疾病研究提供研究基礎(chǔ)。2.LPS刺激下,MCPIP調(diào)節(jié)BV-2細胞中炎癥因子的表達,MCPIP敲低后BV-2細胞表達IL-12b、IL-6增加而IER3表達下降,進一步證明了小膠質(zhì)細胞表達的MCPIP參與調(diào)控顱內(nèi)炎癥反應(yīng)。3.LPS刺激下,MCPIP敲低后BV-2細胞的細胞上清使SH-SY5Y細胞存活率降低、死亡率增高,說明在顱內(nèi)炎癥反應(yīng)過程中MCPIP調(diào)節(jié)了小膠質(zhì)細胞激活介導(dǎo)的神經(jīng)元毒性作用,論證了MCPIP具有神經(jīng)保護的潛在作用。
【關(guān)鍵詞】：單核細胞趨化蛋白1誘導(dǎo)蛋白 小膠質(zhì)細胞 神經(jīng)炎癥 神經(jīng)保護
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-24
• 1. 顱內(nèi)炎癥相關(guān)性疾病18-20
• 2. 單核細胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白與炎癥反應(yīng)20-23
• 3. 研究內(nèi)容及研究目的23-24
• 材料與方法24-36
• 1. 實驗材料與儀器24-26
• 2. 實驗方法26-35
• 3. 統(tǒng)計分析35-36
• 結(jié)果36-42
• 1. LPS和OGD/R誘導(dǎo)BV-2細胞表達MCPIP36-39
• 2. MCPIP調(diào)節(jié)BV-2細胞中炎癥因子的表達39-40
• 3. 抑制MCPIP表達導(dǎo)致BV-2細胞的細胞上清神經(jīng)元毒性增強40-42
• 討論42-50
• 1. 細胞模型及處理因素選擇的合理性42-43
• 2. LPS和OGD/R可誘導(dǎo)BV-2細胞MCPIP表達43-45
• 3. MCPIP抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)45-48
• 4. MCPIP具有保護神經(jīng)元的潛在作用48-50
• 局限性與展望50-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻52-59
• 中英文縮寫詞對照表59-61
• 綜述61-74
• 參考文獻69-74
• 攻讀學(xué)位期間成果74-75
• 致謝75-77

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本文編號：972545