發(fā)布時(shí)間：2017-09-30 00:18

  本文關(guān)鍵詞：人參皂苷Rd對(duì)成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：長期以來,神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域都認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元屬于終末分化細(xì)胞,很難再進(jìn)行分裂和增殖。因而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、變性導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失及神經(jīng)元的損傷難以得到自我修復(fù),神經(jīng)功能的重建被視為不可能�？茖W(xué)家們對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分離培養(yǎng)和增殖的成功,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和功能重建帶來了新的希望。但目前已有的促進(jìn)NSCs增殖和分化的方法都因其臨床治療可操作性不強(qiáng)而制約了臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。因此找到一種促進(jìn)NSCs增殖和定向分化的藥物可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供新的可行途徑。人參皂苷Rd(GSRd)是從人參和三七中提取的一種單體化合物,是它們主要活性成分之一。我們前期的臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),GSRd具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用:治療腦梗死安全有效、減少腦缺血模型大鼠梗死體積、減少神經(jīng)元死亡、促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)等。但GSRd是否能促進(jìn)成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)NSCs的神經(jīng)發(fā)生從而發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)功能呢?目前還鮮有報(bào)道。為此本研究擬在在體和離體探究GSRd對(duì)NSCs增殖及分化的作用并初步探索可能的分子機(jī)制。第一部分GSRd對(duì)成年大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究目的:探究GSRd對(duì)海馬齒狀回NSCs增殖分化的影響。方法:(1)30 mg/kg的GSRd腹腔注射到成年大鼠體內(nèi),每天注射1次,連續(xù)注射1周。GSRd給藥后的第7 d和第14 d處死大鼠,將海馬區(qū)切片,通過Brd U染色、DCX染色,觀察GSRd對(duì)海馬區(qū)NSCs增殖和新生神經(jīng)元的影響。(2)GSRd給藥后的第34 d處死大鼠,將海馬區(qū)切片,進(jìn)行Brd U/Neu N和Brd U/GFAP熒光雙標(biāo)記染色,觀察GSRd對(duì)海馬區(qū)NSCs分化的影響。結(jié)果:(1)GSRd干預(yù)后7 d,GSRd組的海馬齒狀回Brd U和DCX陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.05);GSRd干預(yù)后14 d,GSRd組海馬區(qū)Brd U和DCX陽性細(xì)胞的數(shù)目與對(duì)照組相比無明顯差異。(2)GSRd組的Brd U+/Neu N+雙標(biāo)記細(xì)胞與對(duì)照組相比,數(shù)量明顯增加(P0.05)。但兩組Brd U+/Neu N+雙標(biāo)記細(xì)胞占總Brd U+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外,對(duì)GSRd組和對(duì)照組進(jìn)行Brd U/GFAP免疫熒光雙標(biāo)記染色,兩組均沒有觀察到Brd U+/GFAP+雙標(biāo)記細(xì)胞。結(jié)論:GSRd顯著增加海馬齒狀回NSCs及新生神經(jīng)元的數(shù)量,但對(duì)NSCs的分化并無明顯作用。第二部分GSRd對(duì)培養(yǎng)NSCs增殖分化影響的研究目的:探究GSRd對(duì)體外培養(yǎng)NSCs增殖分化的影響。方法:(1)分離培養(yǎng)胎鼠NSCs并進(jìn)行神經(jīng)球鑒定和分化鑒定。(2)體外培養(yǎng)NSCs,經(jīng)過不同濃度GSRd干預(yù)后,觀察神經(jīng)球的數(shù)量和大小的變化;CCK-8法、Brd U免疫熒光染色分別觀察GSRd對(duì)NSCs存活和增殖的影響。(3)體外培養(yǎng)NSCs,經(jīng)過GSRd干預(yù)后,分別進(jìn)行Tuj-1、GFAP和CNPase免疫熒光染色,觀察GSRd對(duì)NSCs分化的影響。結(jié)果:(1)對(duì)體外培養(yǎng)的NSCs進(jìn)行Nestin、Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)染色,結(jié)果顯示被染色的細(xì)胞呈Nestin陽性和Ki67陽性反應(yīng)。Tuj-1、GFAP、CNPase免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,所培養(yǎng)的NSCs可以定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞,具有多向分化的潛能。(2)與對(duì)照組相比,GSRd組神經(jīng)球的數(shù)目和直徑明顯增加(P0.05);CCK-8法、Brd U免疫熒光染色結(jié)果顯示,GSRd可明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs的存活和增殖(P0.05)。(3)體外培養(yǎng)的NSCs,GSRd處理組Tuj-1、GFAP和CNPase陽性細(xì)胞百分率與對(duì)照組相比無明顯差異。結(jié)論:GSRd可促進(jìn)體外培養(yǎng)NSCs存活和增殖,對(duì)體外培養(yǎng)NSCs的分化無影響。第三部分GSRd促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生機(jī)制的研究目的:探究GSRd促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生可能的分子機(jī)制。方法:(1)Western Blot測定GSRd干預(yù)后的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、PKC、p-PKC蛋白表達(dá)水平;(2)Western Blot測定PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002、MAPK/ERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059干預(yù)下經(jīng)GSRd作用的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表達(dá);(3)CCK-8法、Brd U免疫熒光染色分別觀察LY294002和PD98059干預(yù)下經(jīng)GSRd作用的NSCs的存活和增殖。結(jié)果:(1)與對(duì)照組相比,GSRd組p-Akt、p-ERK蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05),但Akt、ERK、PKC、p-PKC蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。(2)與GSRd組相比,LY294002干預(yù)組和PD98059干預(yù)組p-Akt、p-ERK蛋白表達(dá)降低(P0.05)。(3)LY294002和PD98059可明顯減弱GSRd干預(yù)的NSCs的存活和增殖(P0.05)。結(jié)論:GSRd可能通過PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控NSCs的神經(jīng)發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：人參皂苷Rd 神經(jīng)干細(xì)胞 增殖 分化 PI3K/Akt MAPK/ERK1/2
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)回顧15-25
• 第一部分 NSCS在治療神經(jīng)退行性疾病方面的潛能15-21
• 1 NSCs的性能和特點(diǎn)15-17
• 1.1 增殖和自我更新15-16
• 1.2 多潛能性16-17
• 1.3 分子標(biāo)記17
• 2 神經(jīng)發(fā)生及其潛能17-18
• 3 NSCs治療衰老相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的潛能18-20
• 4 基于NSCs療法的前景20-21
• 第二部分 GSRD在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用21-25
• 1 GSRd具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用21-22
• 2 GSRd對(duì)退行性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用22-25
• 第一部分 GSRD對(duì)成年大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究25-34
• 1 材料25-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及分組25-26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和配制方法26
• 1.3 主要儀器及耗材26
• 2 方法26-28
• 2.1 BrdU給藥26-27
• 2.2 組織準(zhǔn)備27
• 2.3 免疫組織染色27-28
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28
• 3 結(jié)果28-32
• 3.1 GSRd促進(jìn)海馬區(qū)NSC的增殖28-31
• 3.2 BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙標(biāo)記染色結(jié)果31-32
• 4 討論32-34
• 第二部分 GSRD對(duì)體外培養(yǎng)NSCS增殖分化的影響的研究34-52
• 1 材料34-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 1.2 主要試劑和配制方法34-36
• 1.3 主要儀器及耗材36-37
• 2 方法37-42
• 2.1 分離、培養(yǎng)NSCs37-38
• 2.2 體外培養(yǎng)NSCs鑒定38-39
• 2.3 NSCs的凍存和復(fù)蘇39-40
• 2.4 神經(jīng)球計(jì)數(shù)40
• 2.5 CCK-8 檢測40-41
• 2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色41-42
• 3 結(jié)果42-50
• 3.1 大鼠NSCs的分離培養(yǎng)42
• 3.2 原代NSCs的形態(tài)觀察42-43
• 3.3 傳代NSCs的形態(tài)觀察43-44
• 3.4 NSCs鑒定和分化鑒定44-45
• 3.5 復(fù)蘇后的NSCs形態(tài)觀察45
• 3.6 不同濃度的GSRd干預(yù)體外培養(yǎng)神經(jīng)球45-46
• 3.7 不同濃度的GSRd干預(yù)體外培養(yǎng)的NSCs，，對(duì)其存活的影響46-47
• 3.8 GSRd對(duì)體外培養(yǎng)NSCs增殖的影響47-49
• 3.9 GSRd干預(yù)NSCs，對(duì)其分化的影響49-50
• 4 討論50-52
• 第三部分 GSRD促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生機(jī)制的研究52-61
• 1 材料52-53
• 1.1 主要試劑和配制方法52-53
• 1.2 主要儀器及耗材53
• 2 方法53-57
• 2.1 Western Blot法53-56
• 2.2 CCK-8 檢測56
• 2.3 BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色56
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析56-57
• 3 結(jié)果57-60
• 3.1 GSRd激活PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路57
• 3.2 LY294002、PD98059可逆轉(zhuǎn)p-Akt、p-ERK蛋白表達(dá)水平57
• 3.3 LY294002、PD98059減弱了GSRd對(duì)NSCs促增殖作用57-60
• 4 討論60-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-73
• 附錄73-74
• 個(gè)人簡歷和研究成果74-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：945064