本文關鍵詞：人參皂苷Rd對成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生的影響及機制研究

  更多相關文章： 人參皂苷Rd 神經(jīng)干細胞 增殖 分化 PI3K/Akt MAPK/ERK1/2

【摘要】：長期以來,神經(jīng)病學領域都認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元屬于終末分化細胞,很難再進行分裂和增殖。因而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、變性導致的神經(jīng)元丟失及神經(jīng)元的損傷難以得到自我修復,神經(jīng)功能的重建被視為不可能。科學家們對體外神經(jīng)干細胞(NSCs)分離培養(yǎng)和增殖的成功,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和功能重建帶來了新的希望。但目前已有的促進NSCs增殖和分化的方法都因其臨床治療可操作性不強而制約了臨床轉化應用。因此找到一種促進NSCs增殖和定向分化的藥物可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供新的可行途徑。人參皂苷Rd(GSRd)是從人參和三七中提取的一種單體化合物,是它們主要活性成分之一。我們前期的臨床和基礎研究發(fā)現(xiàn),GSRd具有明確的神經(jīng)保護作用:治療腦梗死安全有效、減少腦缺血模型大鼠梗死體積、減少神經(jīng)元死亡、促進大鼠運動功能恢復等。但GSRd是否能促進成年哺乳動物腦內(nèi)NSCs的神經(jīng)發(fā)生從而發(fā)揮神經(jīng)修復功能呢?目前還鮮有報道。為此本研究擬在在體和離體探究GSRd對NSCs增殖及分化的作用并初步探索可能的分子機制。第一部分GSRd對成年大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究目的:探究GSRd對海馬齒狀回NSCs增殖分化的影響。方法:(1)30 mg/kg的GSRd腹腔注射到成年大鼠體內(nèi),每天注射1次,連續(xù)注射1周。GSRd給藥后的第7 d和第14 d處死大鼠,將海馬區(qū)切片,通過Brd U染色、DCX染色,觀察GSRd對海馬區(qū)NSCs增殖和新生神經(jīng)元的影響。(2)GSRd給藥后的第34 d處死大鼠,將海馬區(qū)切片,進行Brd U/Neu N和Brd U/GFAP熒光雙標記染色,觀察GSRd對海馬區(qū)NSCs分化的影響。結果:(1)GSRd干預后7 d,GSRd組的海馬齒狀回Brd U和DCX陽性細胞數(shù)明顯增加(P0.05);GSRd干預后14 d,GSRd組海馬區(qū)Brd U和DCX陽性細胞的數(shù)目與對照組相比無明顯差異。(2)GSRd組的Brd U+/Neu N+雙標記細胞與對照組相比,數(shù)量明顯增加(P0.05)。但兩組Brd U+/Neu N+雙標記細胞占總Brd U+細胞百分數(shù)無統(tǒng)計學差異。另外,對GSRd組和對照組進行Brd U/GFAP免疫熒光雙標記染色,兩組均沒有觀察到Brd U+/GFAP+雙標記細胞。結論:GSRd顯著增加海馬齒狀回NSCs及新生神經(jīng)元的數(shù)量,但對NSCs的分化并無明顯作用。第二部分GSRd對培養(yǎng)NSCs增殖分化影響的研究目的:探究GSRd對體外培養(yǎng)NSCs增殖分化的影響。方法:(1)分離培養(yǎng)胎鼠NSCs并進行神經(jīng)球鑒定和分化鑒定。(2)體外培養(yǎng)NSCs,經(jīng)過不同濃度GSRd干預后,觀察神經(jīng)球的數(shù)量和大小的變化;CCK-8法、Brd U免疫熒光染色分別觀察GSRd對NSCs存活和增殖的影響。(3)體外培養(yǎng)NSCs,經(jīng)過GSRd干預后,分別進行Tuj-1、GFAP和CNPase免疫熒光染色,觀察GSRd對NSCs分化的影響。結果:(1)對體外培養(yǎng)的NSCs進行Nestin、Ki67免疫細胞化學染色,結果顯示被染色的細胞呈Nestin陽性和Ki67陽性反應。Tuj-1、GFAP、CNPase免疫細胞化學染色結果顯示,所培養(yǎng)的NSCs可以定向分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞以及少突膠質細胞,具有多向分化的潛能。(2)與對照組相比,GSRd組神經(jīng)球的數(shù)目和直徑明顯增加(P0.05);CCK-8法、Brd U免疫熒光染色結果顯示,GSRd可明顯促進體外培養(yǎng)的NSCs的存活和增殖(P0.05)。(3)體外培養(yǎng)的NSCs,GSRd處理組Tuj-1、GFAP和CNPase陽性細胞百分率與對照組相比無明顯差異。結論:GSRd可促進體外培養(yǎng)NSCs存活和增殖,對體外培養(yǎng)NSCs的分化無影響。第三部分GSRd促進神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生機制的研究目的:探究GSRd促進神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生可能的分子機制。方法:(1)Western Blot測定GSRd干預后的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、PKC、p-PKC蛋白表達水平;(2)Western Blot測定PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002、MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑PD98059干預下經(jīng)GSRd作用的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表達;(3)CCK-8法、Brd U免疫熒光染色分別觀察LY294002和PD98059干預下經(jīng)GSRd作用的NSCs的存活和增殖。結果:(1)與對照組相比,GSRd組p-Akt、p-ERK蛋白表達明顯增加(P0.05),但Akt、ERK、PKC、p-PKC蛋白表達與對照組相比無明顯差異。(2)與GSRd組相比,LY294002干預組和PD98059干預組p-Akt、p-ERK蛋白表達降低(P0.05)。(3)LY294002和PD98059可明顯減弱GSRd干預的NSCs的存活和增殖(P0.05)。結論:GSRd可能通過PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2信號通路調(diào)控NSCs的神經(jīng)發(fā)生。
【關鍵詞】：人參皂苷Rd 神經(jīng)干細胞 增殖 分化 PI3K/Akt MAPK/ERK1/2
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-25
• 第一部分 NSCS在治療神經(jīng)退行性疾病方面的潛能15-21
• 1 NSCs的性能和特點15-17
• 1.1 增殖和自我更新15-16
• 1.2 多潛能性16-17
• 1.3 分子標記17
• 2 神經(jīng)發(fā)生及其潛能17-18
• 3 NSCs治療衰老相關神經(jīng)退行性疾病的潛能18-20
• 4 基于NSCs療法的前景20-21
• 第二部分 GSRD在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用21-25
• 1 GSRd具有明確的神經(jīng)保護作用21-22
• 2 GSRd對退行性疾病的神經(jīng)保護作用22-25
• 第一部分 GSRD對成年大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究25-34
• 1 材料25-26
• 1.1 實驗動物以及分組25-26
• 1.2 實驗試劑和配制方法26
• 1.3 主要儀器及耗材26
• 2 方法26-28
• 2.1 BrdU給藥26-27
• 2.2 組織準備27
• 2.3 免疫組織染色27-28
• 2.4 統(tǒng)計學分析28
• 3 結果28-32
• 3.1 GSRd促進海馬區(qū)NSC的增殖28-31
• 3.2 BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙標記染色結果31-32
• 4 討論32-34
• 第二部分 GSRD對體外培養(yǎng)NSCS增殖分化的影響的研究34-52
• 1 材料34-37
• 1.1 實驗動物34
• 1.2 主要試劑和配制方法34-36
• 1.3 主要儀器及耗材36-37
• 2 方法37-42
• 2.1 分離、培養(yǎng)NSCs37-38
• 2.2 體外培養(yǎng)NSCs鑒定38-39
• 2.3 NSCs的凍存和復蘇39-40
• 2.4 神經(jīng)球計數(shù)40
• 2.5 CCK-8 檢測40-41
• 2.6 免疫細胞化學染色41-42
• 3 結果42-50
• 3.1 大鼠NSCs的分離培養(yǎng)42
• 3.2 原代NSCs的形態(tài)觀察42-43
• 3.3 傳代NSCs的形態(tài)觀察43-44
• 3.4 NSCs鑒定和分化鑒定44-45
• 3.5 復蘇后的NSCs形態(tài)觀察45
• 3.6 不同濃度的GSRd干預體外培養(yǎng)神經(jīng)球45-46
• 3.7 不同濃度的GSRd干預體外培養(yǎng)的NSCs，，對其存活的影響46-47
• 3.8 GSRd對體外培養(yǎng)NSCs增殖的影響47-49
• 3.9 GSRd干預NSCs，對其分化的影響49-50
• 4 討論50-52
• 第三部分 GSRD促進神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生機制的研究52-61
• 1 材料52-53
• 1.1 主要試劑和配制方法52-53
• 1.2 主要儀器及耗材53
• 2 方法53-57
• 2.1 Western Blot法53-56
• 2.2 CCK-8 檢測56
• 2.3 BrdU免疫細胞化學染色56
• 2.4 統(tǒng)計學分析56-57
• 3 結果57-60
• 3.1 GSRd激活PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2 信號通路57
• 3.2 LY294002、PD98059可逆轉p-Akt、p-ERK蛋白表達水平57
• 3.3 LY294002、PD98059減弱了GSRd對NSCs促增殖作用57-60
• 4 討論60-61
• 小結61-62
• 參考文獻62-73
• 附錄73-74
• 個人簡歷和研究成果74-75
• 致謝75

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