本文關鍵詞：MiR-566調控VHL影響人腦膠質瘤細胞VEGF表達的體內外研究

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【摘要】：人腦膠質母細胞瘤是中樞神經系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一,它具有高度血管化的特征,患者中位生存期一般不超過12個月。盡管人類在癌癥的生物學研究和治療方面取得了很大的進展,但是,我們對膠質瘤這種惡性程度較高的腫瘤的研究尚未深入,其確切的發(fā)病機制仍然不清楚,臨床上治療以手術切除為主,術后再加以放化療以及免疫治療等,總體治療效果較差,腫瘤復發(fā)率高。因此,探討膠質母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制具有十分重要的意義。Mi RN A(Micro RNA)是一類非編碼RN A,它是在真核生物中發(fā)現的,具有調控功能,其大小長約20~25個核苷酸【1】,它參與多種調節(jié)途徑,例如發(fā)育過程、造血過程、細胞增殖與凋亡等等【2、3】。研究表明,mi RNA與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,它可通過調控其靶基因參與的信號通路進而在膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮致癌或者抑癌的作用【1】,mi RNA可作為今后膠質瘤分子治療方向上一個新的突破點。VHL(Von Hippel-Lindau)基因最早是由Von Hippel【4】及Linda【5】發(fā)現,是一種重要的腫瘤抑制基因【6、7】,定位于3p25~26區(qū)【7】,編碼213個氨基酸的蛋白質,稱為VHL蛋白,VHL基因突變與多種腫瘤的發(fā)生相關,例如腎細胞癌、嗜鉻細胞瘤、胰腺癌、中樞神經系統(tǒng)血管瘤等【8】,VHL與膠質瘤之間的關系主要為VHL可參與HIF-1α泛素化降解的過程【9、10】進而影響VEGF(vascular endothelial growth factor)的表達,而VEGF在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是最為重要的血管形成因子【11】。VHL除了調節(jié)HIF-α水平和抗血管生成外,還具有調節(jié)細胞凋亡【12】、細胞周期【13】、細胞外基質的作用【14】。我課題組前期研究工作提示VHL基因在膠質母細胞瘤中表達降低,并與患者生存期存在負相關(尚未發(fā)表數據),在對膠質瘤患者的研究中發(fā)現,mi R-566與膠質瘤發(fā)生、惡性程度、愈后密切相關【9】,生物信息學預測VHL基因受mi R-566調控(www.targetscan.org)。因此,在mi R-566、VHL和VEGF之間可能存在某種調控關系,該種調控關系對膠質瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的作用。本研究將探討mi R-566調控VHL對人腦膠質瘤中VEGF表達的影響,探尋新的有可能成為膠質瘤治療的靶點,能夠為膠質瘤的綜合治療提供更新的有效的方法和思路。本課題研究內容將分為以下兩個部分:第一部分為mi RNA-566在人腦膠質瘤細胞中調控VHL影響VEGF表達的研究。我們首先用表達反義mi R-566的慢病毒(lenti-AS-mi R-566)侵染U87膠質瘤細胞,采用Real time PCR檢測mi RNA-566及VEGF m RNA的表達,采用Western blot檢測VHL、HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達。其次用VHL表達質粒轉染U87膠質瘤細胞,Western blot檢測VHL、HIF-1α、VEGF蛋白的表達情況。最后采用熒光素酶報告基因實驗驗證mi R-566與VHL之間的調控關系。結果顯示lenti-AS-mi R-566處理組U87細胞中mi RNA-566、VEGF m RNA和HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白的表達顯著降低,VHL蛋白表達增高;VHL表達質粒轉染U87膠質瘤細胞后,VHL蛋白的表達增高;HIF-1α和VEGF蛋白的表達下降,熒光素酶報告基因實驗結果顯示VHL是mi R-566的調控靶點,表明mi RNA-566在U87膠質瘤細胞中可直接調控VHL基因影響HIF-1α的表達,進而影響膠質瘤細胞中VEGF的表達,并且對膠質瘤細胞的侵襲性產生影響。第二部分為構建裸鼠顱內模型,進一步驗證mi RNA-566在體內調控VHL影響VEGF的表達。用lenti-AS-mi R-566處理后的U87細胞建立裸鼠顱內模型,利用熒光原位雜交法(FISH)和免疫組織化學染色法對顱內模型組織切片中mi R-566和相關蛋白表達進行檢測。結果顯示組織切片中,熒光原位雜交證實處理組mi R-566表達減少,免疫組織化學染色證實處理組VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低,VHL蛋白表達增高,再次驗證mi RNA-566可直接調控VHL基因的表達進而影響膠質瘤中VEGF的表達,并影響膠質瘤的侵襲性。結論:通過熒光素酶實驗和蛋白免疫印跡檢測實驗,我們證實了VHL基因是mi R-566的靶基因,通過體內和體外實驗的研究,我們發(fā)現抑制mi R-566的表達可以使HIF-1α、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表達顯著降低,VHL蛋白表達增高;上調VHL的表達,可以抑制HIF-1α和VEGF的表達。這些數據表明:mi R-566可通過調控VHL基因進而影響VEGF的表達,并對膠質瘤細胞的侵襲性產生影響。
【關鍵詞】：miR-566 VHL HIF-1α VEGF 人腦膠質瘤
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 第1章 前言11-13
• 1.1 研究現狀、成果11-12
• 1.2 研究目的、方法12-13
• 第2章 MiRNA-566 在人腦膠質瘤細胞中調控VHL影響VEGF表達的研究13-29
• 2.1 對象與方法13-23
• 2.1.1 對象13-15
• 2.1.2 方法15-23
• 2.1.3 統(tǒng)計學方法23
• 2.2 結果23-27
• 2.2.1 Real time PCR驗證lenti-AS-566 轉染效率以及轉染后VEGFmRNA的表達水平23-25
• 2.2.2 Western Blot檢測經lenti-AS- miR-566 轉染后U87 膠質細胞瘤中相關蛋白的變化25-26
• 2.2.3 Western Blot檢測經VHL表達質粒轉染后U87 膠質細胞瘤中相關蛋白的變化26-27
• 2.2.4 熒光素酶報告載體實驗結果27
• 2.3 討論27-28
• 2.4 小結28-29
• 第3章 MiRNA-566 調控VHL影響VEGF表達的體內研究29-37
• 3.1 對象與方法29-33
• 3.1.1 對象29-30
• 3.1.2 方法30-33
• 3.1.3 統(tǒng)計學方法33
• 3.2 結果33-34
• 3.2.1 原位雜交檢測miR-566 在腦組織切片中的表達33
• 3.2.2 免疫組織化學染色法對切片中相關基因的檢測33-34
• 3.3 討論34-36
• 3.4 小結36-37
• 第4章 結論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻39-41
• 攻讀學位期間的研究成果41-42
• 綜述42-47
• 參考文獻46-47

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