本文關(guān)鍵詞：MiR-566調(diào)控VHL影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的體內(nèi)外研究

  更多相關(guān)文章： miR-566 VHL HIF-1α VEGF 人腦膠質(zhì)瘤

【摘要】：人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一,它具有高度血管化的特征,患者中位生存期一般不超過12個(gè)月。盡管人類在癌癥的生物學(xué)研究和治療方面取得了很大的進(jìn)展,但是,我們對膠質(zhì)瘤這種惡性程度較高的腫瘤的研究尚未深入,其確切的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚,臨床上治療以手術(shù)切除為主,術(shù)后再加以放化療以及免疫治療等,總體治療效果較差,腫瘤復(fù)發(fā)率高。因此,探討膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有十分重要的意義。Mi RN A(Micro RNA)是一類非編碼RN A,它是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的,具有調(diào)控功能,其大小長約20~25個(gè)核苷酸【1】,它參與多種調(diào)節(jié)途徑,例如發(fā)育過程、造血過程、細(xì)胞增殖與凋亡等等【2、3】。研究表明,mi RNA與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它可通過調(diào)控其靶基因參與的信號通路進(jìn)而在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮致癌或者抑癌的作用【1】,mi RNA可作為今后膠質(zhì)瘤分子治療方向上一個(gè)新的突破點(diǎn)。VHL(Von Hippel-Lindau)基因最早是由Von Hippel【4】及Linda【5】發(fā)現(xiàn),是一種重要的腫瘤抑制基因【6、7】,定位于3p25~26區(qū)【7】,編碼213個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),稱為VHL蛋白,VHL基因突變與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān),例如腎細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管瘤等【8】,VHL與膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系主要為VHL可參與HIF-1α泛素化降解的過程【9、10】進(jìn)而影響VEGF(vascular endothelial growth factor)的表達(dá),而VEGF在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是最為重要的血管形成因子【11】。VHL除了調(diào)節(jié)HIF-α水平和抗血管生成外,還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡【12】、細(xì)胞周期【13】、細(xì)胞外基質(zhì)的作用【14】。我課題組前期研究工作提示VHL基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)降低,并與患者生存期存在負(fù)相關(guān)(尚未發(fā)表數(shù)據(jù)),在對膠質(zhì)瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn),mi R-566與膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡性程度、愈后密切相關(guān)【9】,生物信息學(xué)預(yù)測VHL基因受mi R-566調(diào)控(www.targetscan.org)。因此,在mi R-566、VHL和VEGF之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系,該種調(diào)控關(guān)系對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的作用。本研究將探討mi R-566調(diào)控VHL對人腦膠質(zhì)瘤中VEGF表達(dá)的影響,探尋新的有可能成為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn),能夠?yàn)槟z質(zhì)瘤的綜合治療提供更新的有效的方法和思路。本課題研究內(nèi)容將分為以下兩個(gè)部分:第一部分為mi RNA-566在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)控VHL影響VEGF表達(dá)的研究。我們首先用表達(dá)反義mi R-566的慢病毒(lenti-AS-mi R-566)侵染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞,采用Real time PCR檢測mi RNA-566及VEGF m RNA的表達(dá),采用Western blot檢測VHL、HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。其次用VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞,Western blot檢測VHL、HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)情況。最后采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證mi R-566與VHL之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示lenti-AS-mi R-566處理組U87細(xì)胞中mi RNA-566、VEGF m RNA和HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低,VHL蛋白表達(dá)增高;VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,VHL蛋白的表達(dá)增高;HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)下降,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示VHL是mi R-566的調(diào)控靶點(diǎn),表明mi RNA-566在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可直接調(diào)控VHL基因影響HIF-1α的表達(dá),進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá),并且對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性產(chǎn)生影響。第二部分為構(gòu)建裸鼠顱內(nèi)模型,進(jìn)一步驗(yàn)證mi RNA-566在體內(nèi)調(diào)控VHL影響VEGF的表達(dá)。用lenti-AS-mi R-566處理后的U87細(xì)胞建立裸鼠顱內(nèi)模型,利用熒光原位雜交法(FISH)和免疫組織化學(xué)染色法對顱內(nèi)模型組織切片中mi R-566和相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示組織切片中,熒光原位雜交證實(shí)處理組mi R-566表達(dá)減少,免疫組織化學(xué)染色證實(shí)處理組VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低,VHL蛋白表達(dá)增高,再次驗(yàn)證mi RNA-566可直接調(diào)控VHL基因的表達(dá)進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤中VEGF的表達(dá),并影響膠質(zhì)瘤的侵襲性。結(jié)論:通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡檢測實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了VHL基因是mi R-566的靶基因,通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的研究,我們發(fā)現(xiàn)抑制mi R-566的表達(dá)可以使HIF-1α、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低,VHL蛋白表達(dá)增高;上調(diào)VHL的表達(dá),可以抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明:mi R-566可通過調(diào)控VHL基因進(jìn)而影響VEGF的表達(dá),并對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性產(chǎn)生影響。
【關(guān)鍵詞】：miR-566 VHL HIF-1α VEGF 人腦膠質(zhì)瘤
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 第1章 前言11-13
• 1.1 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 1.2 研究目的、方法12-13
• 第2章 MiRNA-566 在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)控VHL影響VEGF表達(dá)的研究13-29
• 2.1 對象與方法13-23
• 2.1.1 對象13-15
• 2.1.2 方法15-23
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法23
• 2.2 結(jié)果23-27
• 2.2.1 Real time PCR驗(yàn)證lenti-AS-566 轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染后VEGFmRNA的表達(dá)水平23-25
• 2.2.2 Western Blot檢測經(jīng)lenti-AS- miR-566 轉(zhuǎn)染后U87 膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)蛋白的變化25-26
• 2.2.3 Western Blot檢測經(jīng)VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U87 膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)蛋白的變化26-27
• 2.2.4 熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果27
• 2.3 討論27-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第3章 MiRNA-566 調(diào)控VHL影響VEGF表達(dá)的體內(nèi)研究29-37
• 3.1 對象與方法29-33
• 3.1.1 對象29-30
• 3.1.2 方法30-33
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法33
• 3.2 結(jié)果33-34
• 3.2.1 原位雜交檢測miR-566 在腦組織切片中的表達(dá)33
• 3.2.2 免疫組織化學(xué)染色法對切片中相關(guān)基因的檢測33-34
• 3.3 討論34-36
• 3.4 小結(jié)36-37
• 第4章 結(jié)論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果41-42
• 綜述42-47
• 參考文獻(xiàn)46-47

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本文編號：934617