發(fā)布時間：2017-09-26 06:30

  本文關鍵詞：酸感受器GPR65調控膠質瘤惡性增殖機制及預后相關性研究

  更多相關文章： GPR65 TCGA 膠質瘤 組織芯片 增殖 臨床預后

【摘要】：研究背景及目的：腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,約占腦內所有惡性腫瘤的80%,其中惡性程度和發(fā)病率最高者(65%)為膠質母細胞瘤(GBM, WHO IV級)。其預后不佳,死亡率極高,使惡性膠質瘤成為目前神經外科疾病治療的重點和難點。傳統(tǒng)的治療策略包括手術切除及輔以術后放化療,以替莫唑胺(TMZ)聯合放療為標準方案的術后輔助治療也在一定程度上延長了患者總體生存時間(OS)。然而由于膠質瘤高度復發(fā)、惡性侵襲的特性及TMZ等化療藥耐藥等因素,GBM和間變型膠質細胞瘤(WHO Ⅲ級)患者中位生存時間仍然分別只有12～15個月和2-5年。如何改善膠質瘤患者的預后一直是神經外科領域的難題。隨著分子生物學和基因組學的發(fā)展,對與腫瘤發(fā)生過程中的基因事件及分子機制的研究也更加深入,靶向腫瘤細胞內核心信號通路中的關鍵分子,抑制受體激活、阻斷信號傳導等,從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長,促進腫瘤細胞凋亡,已成為腫瘤研究的熱點。由此,闡明膠質瘤的分子病理機制,尋找能夠有效治療膠質瘤的關鍵分子靶點顯得十分重要。高通量技術的快速發(fā)展無疑為實現分子靶向治療提供了強有力的支持。利用二代測序、基因芯片、組織芯片等技術,分析腫瘤樣本中基因及分子水平變化,結合詳細患者隨訪資料,比較病例的療效及生存時間迥異,進而篩選出差異表達基因,是尋找腫瘤分子靶標的可靠手段。TCGA數據庫即是在此背景下由美國國家癌癥研究所和美國國家人類基因組研究所于2005年共同發(fā)起建立,旨在通過高通量技術研究加深對腫瘤分子基礎的理解,而GBM是該項目重點聚焦并最先開展深入研究的腫瘤。通過聚類分析、差異表達分析和生存分析,整合腦膠質瘤患者的基因芯片數據及TCGA數據庫中GBM樣本的基因表達譜數據和患者臨床相關資料,以此尋找那些在腦膠質瘤中表達異常并與患者預后相關的基因。這些結果不僅能夠有助于我們理解腦膠質瘤發(fā)生的分子病理機制,同時還可能揭示一些對腦膠質瘤預后有判斷價值的分子標記物,進而幫助實現真正意義上的個體化治療。G-蛋白偶聯受體-65(GPR65)為G-蛋白偶聯受體(GPCRs)家族中的一個重要成員,是一類敏感的質子傳感器。既往研究顯示惡性腫瘤細胞生長代謝迅速,造成氧乏進入糖酵解途徑產能,含有大量乳酸的代謝產物堆積,使得腫瘤細胞周圍形成微酸性環(huán)境。GRP65能夠感受這種細胞外環(huán)境中pH的變化,及時調整下游能量代謝和協(xié)調炎癥反應、免疫應答等過程,從而使腫瘤細胞獲得更多的生存優(yōu)勢,促進腫瘤細胞增殖。然而,目前國內外文獻中均無GPR65在膠質瘤中相關的研究報道。我們擬通過數據庫及多樣本信息篩選及驗證GPR65對膠質瘤患者預后判斷的價值,并利用體外實驗研究GPR65在膠質瘤惡性增殖中的作用機制。研究方法及結果：前期我們收集了15例的膠質瘤樣本,經病理證實WHO Ⅰ級1例,WHO Ⅱ級7例,WHO Ⅲ級2例及WHO Ⅳ級5例,并對患者進行隨訪獲得生存期,截止隨訪終點,共有7名患者死亡,8名患者仍健在,15名患者生存期為5-85個月,中位生存時間65個月。繼而將腫瘤組織裂解、抽提RNA及轉化cDNA,制備成基因芯片,通過雜交測序方法獲得表達譜基因信號值。根據患者隨訪截止時的生存狀態(tài)分組,對兩組患者的每個基因進行t檢驗、差異倍數計算及熱圖分析,在p值小于0.015水平,兩組間基因表達差異2倍時,發(fā)現134個基因能夠明確區(qū)分預后不同的兩組膠質瘤患者。在TCGA的528例GBM及10例正常腦組織中,我們利用秩和檢驗、Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗來驗證這134個基因在腫瘤中的表達及與患者生存期的相關性。經過逐個基因驗證分析,我們發(fā)現GPR65在GBM組織中表達明顯上調(p0.001),并與患者的生存期明顯相關,GPR65高表達者中位OS明顯短于低表達者(中位OS 11.7個月vs.14.2個月,p=0.003)。通過在自主建立的基因芯片及公開的TCGA數據庫中初步篩選,我們發(fā)現GPR65基因在膠質瘤中表達明顯上調,并可作為預后因子預測GBM患者預后,提示其可能在膠質瘤發(fā)生及進展過程中扮演重要角色。隨后,我們收集經病理證實的300例膠質瘤樣本(WHO Ⅰ級11例,WHO Ⅱ級109例,WHO Ⅲ級47例,WHO Ⅳ級133例)及16例正常腦組織制備成高通量組織芯片,并對腦膠質瘤患者跟蹤隨訪,再利用免疫組化的方法進一步驗證GPR65的表達及預后判斷作用。隨訪結果顯示285名患者獲得完整隨訪數據,截止2013年9月隨訪結束,39.3%患者仍存活,35.4%患者影像學未見明顯腫瘤復發(fā),患者中位總體生存時間(OS)為30個月,中位無進展生存期(PFS)為26個月。免疫組化顯示GPR65主要定位于靶細胞的細胞漿,其在腦膠質瘤中表達水平明顯上調(免疫組化得分4.295±3.063 vs.1.00±1.225,p0.001)。Kaplan-Meier生存曲線顯示117例GPR65高表達患者的中位OS及中位PFS均明顯短于164例GPR65低表達患者(OS：15個月vs.34個月,p0.001；PFS：12個月vs.30個月,p0.001)。進一步的分層分析指出,在102例原發(fā)GBM患者中,GPR65的高表達(58/102)也預示著較短的中位OS及中位PFS(OS：11個月vs.14個月,p=0.01；PFS：8個月vs.11個月,p=0.022)。多因素Cox比例風險回歸顯示,GPR65表達是原發(fā)GBM患者OS(Hazard Ratio=1.599,95%CI 1.028-2.487, p=0.037)及PFS (Hazard Ratio=1.593,95%CI 1.036-2.450, p=0.034)的獨立預測因子。為了進一步研究GPR65在膠質瘤中多發(fā)揮的具體功能,我們首先利用慢病毒感染的方法構建了干擾和過表達GPR65基因及空載質粒對照的腦膠質瘤細胞系U251。熒光顯微鏡、定量PCR及Western blot實驗證實GPR65干擾和過表達效果穩(wěn)定。繼而再通過CCK-8法檢測細胞增殖曲線變化、克隆形成實驗檢測腫瘤細胞克隆形成能力變化、流式細胞儀測腫瘤細胞周期比例變化等。結果發(fā)現改變內源性GPR65表達水平后,對空載質粒對照組相比,GPR65過表達可促進膠質瘤細胞增殖及提高克隆形成能力；GPR65敲減后膠質瘤細胞增殖速率及克隆形成能力明顯下降,且細胞周期被阻滯在G2期。結論：綜上所述,我們通過芯片及TCGA大數據分析結合臨床組織樣本篩選,驗證了GPR65基因在腦膠質瘤中表達上調,可判斷膠質瘤患者的臨床預后,是原發(fā)GBM患者預后的獨立預測因子。同時,體外實驗證實GPR65可促進膠質瘤惡性增殖。由此,GPR65可作為膠質瘤分子靶向治療的候選靶點行值得進一步研究。
【關鍵詞】：GPR65 TCGA 膠質瘤 組織芯片 增殖 臨床預后
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-17
• 參考文獻15-17
• 第一部分：基因芯片中腦膠質瘤預后相關的基因篩選及數據庫驗證17-30
• 引言17-18
• 材料與方法18-23
• 結果23-28
• 討論28-29
• 參考文獻29-30
• 第二部分：GPR65基因在腦膠質瘤組織中的表達及與患者預后相關性研究30-49
• 引言30-31
• 材料與方法31-35
• 結果35-46
• 討論46-48
• 參考文獻48-49
• 第三部分：GPR65基因調控腦膠質瘤惡性增殖的機制研究49-68
• 引言49-50
• 材料與方法50-60
• 結果60-64
• 討論64-66
• 參考文獻66-68
• 全文總結68-69
• 綜述169-79
• 參考文獻76-79
• 綜述279-90
• 參考文獻85-90
• 研究生期間發(fā)表的文章和參與的科研項目90-92
• 致謝92

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 張權;~(31)P-MRS技術原理及在活體組織中的應用[J];國外醫(yī)學(臨床放射學分冊);2004年01期

2 張思佳;段小紅;焦陽;周密;;細胞內pH值測定方法的研究進展[J];現代生物醫(yī)學進展;2014年21期

中國博士學位論文全文數據庫 前1條

1 王亞鵬;成人腦干膠質瘤預后的影響因素分析[D];中南大學;2014年

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 劉巧紅;尼妥珠單抗聯合化療治療晚期惡性實體瘤的臨床觀察[D];泰山醫(yī)學院;2014年

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本文編號：921990