本文關(guān)鍵詞：三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂1b對A型肉毒毒素重鏈促Neuro-2a細(xì)胞突起生長的干預(yù)作用

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【摘要】：目的:確定Neuro-2a細(xì)胞株是否可用于A型肉毒毒素重鏈(botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain,Bo NT/A HC)體外實(shí)驗(yàn)的研究;觀察不同濃度的Bo NT/A HC作用后對Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起生長的影響,并探討其機(jī)制;外源性增強(qiáng)或抑制三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂(Trisialoganglioside 1b,GT1b)對Bo NT/A HC促Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起生長作用的影響。方法:1.采用激光共聚焦顯微鏡觀察Neuro-2a細(xì)胞膜上突觸囊泡蛋白2(Synaptic vesicle 2,SV2)和三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂1b(Trisialoganglioside 1b,GT1b)的表達(dá)情況:體外培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞一定時(shí)間后取出細(xì)胞培養(yǎng)板,進(jìn)行固定、透膜、封閉、一抗、熒光二抗孵育等處理后置于Olympus激光共聚焦顯微鏡下觀察。2.觀察Bo NT/A HC作用后Neuro-2a細(xì)胞突起生長情況:細(xì)胞接種一定時(shí)間(4h)后加入不同濃度的Bo NT/A HC,并設(shè)對照組(只加入等體積的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液),加入Bo NT/A HC不同時(shí)間后,在相差顯微鏡下觀察Neuro-2a細(xì)胞突起生長情況并進(jìn)行攝像;對圖片上的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)突起長度的測定、計(jì)數(shù)細(xì)胞突起總數(shù)以及有突起的細(xì)胞占圖片細(xì)胞總數(shù)的百分比(%)。3.采用In Cell Western以及常規(guī)Western Blot的方法檢測Bo NT/A HC作用不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)再生相關(guān)信號(hào)蛋白磷酸化狀態(tài)的變化。選用的再生信號(hào)蛋白為Akt/PKB、ERK1/2:(1)In Cell Western法:對不同時(shí)間點(diǎn)不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行固定、透膜、封閉、加入相應(yīng)一抗、紅外染料標(biāo)記二抗,用LI-COR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。此法具有靈敏度高、既可檢測蛋白的功能狀態(tài),同時(shí)又可確定目的蛋白的細(xì)胞定位的優(yōu)點(diǎn);(2)常規(guī)Western Blot的方法:細(xì)胞經(jīng)RIPA緩沖液裂解、提取全漿蛋白、蛋白濃度測定、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗和HRP標(biāo)記二抗孵育、顯色及曝光,隨之檢測蛋白表達(dá)情況。4.外源性加入GT1b或TVL(Triticum vulgaris Lectin,麥胚凝集素)以增加或抑制Neuro-2a細(xì)胞膜上GT1b的含量或功能,觀察其對Bo NT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞突起生長的干預(yù)作用:細(xì)胞接種后即在培養(yǎng)液內(nèi)加入一定濃度的GT1b或TVL,以增強(qiáng)或者抑制Neuro-2a細(xì)胞膜上GT1b的含量或功能;于細(xì)胞接種4h后加入0.1nmol/L的Bo NT/A HC,在不同時(shí)間點(diǎn)將細(xì)胞置于相差顯微鏡下觀察其突起生長狀況,并提取全漿蛋白檢測再生相關(guān)蛋白的磷酸化情況。結(jié)果:1.Neuro-2a細(xì)胞膜上存在與Bo NT/A HC結(jié)合的高親和力受體(SV2)以及低親和力受體(GT1b)的表達(dá),表明Neuro-2a細(xì)胞可用于Bo NT/A HC相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)。2.將不同濃度的Bo NT/A HC加入細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi),觀察其對細(xì)胞突起生長的影響發(fā)現(xiàn):Bo NT/A HC作用后細(xì)胞突起長度增加、細(xì)胞突起數(shù)量增多以及有突起細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比增加,同時(shí)觀察到隨Bo NT/A HC濃度的增加其促進(jìn)突起生長的作用也增強(qiáng),但當(dāng)濃度增大到10nmol/L時(shí)細(xì)胞突起生長出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。3.In Cell Western以及常規(guī)Western Blot的方法檢測細(xì)胞內(nèi)再生相關(guān)蛋白磷酸化變化的結(jié)果顯示:加入0.1nmol/L的Bo NT/A HC后。Akt和ERK1/2的磷酸化均增高,表現(xiàn)為相同濃度(0.1nmol/L)的Bo NT/A HC作用后phospho-Akt在1h時(shí)表達(dá)最強(qiáng),而phospho-ERK1/2在2h時(shí)達(dá)高峰,對相同時(shí)間不同濃度的Bo NT/A HC作用效果觀察可以發(fā)現(xiàn)0.1nmol/L的Bo NT/A HC處理后與其他濃度組相比phospho-Akt和phospho-ERK1/2的表達(dá)都最強(qiáng)。4.培養(yǎng)液內(nèi)外源性加入GT1b使得細(xì)胞膜上的GT1b含量增多,在此基礎(chǔ)上再給予一定濃度(0.1nmol/L)的Bo NT/A HC作用于Neuro-2a細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)增加細(xì)胞膜上GT1b后增強(qiáng)了Bo NT/A HC促Neuro-2a細(xì)胞突起生長作用,突起的長度、突起數(shù)量以及有突起的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比較單純Bo NT/A HC組增加;除此外,In Cell Western和常規(guī)Western Blot的檢測結(jié)果也顯示增加細(xì)胞膜上GT1b的含量后使得phospho-Akt和phospho-ERK1/2的峰值提前至作用后的30min和90min;培養(yǎng)液內(nèi)加入TVL結(jié)合細(xì)胞膜上GT1b后再加入Bo NT/A HC(0.1nmol/L)發(fā)現(xiàn):消耗細(xì)胞膜上GT1b后Bo NT/A HC的促再生作用減弱甚至消失,In Cell Western和常規(guī)Western Blot的檢測結(jié)果還表明:用TVL耗竭細(xì)胞膜上的GT1b后phospho-Akt和phospho-ERK1/2的變化與對照組相比無明顯差異,且也未顯示時(shí)間效應(yīng)變化。結(jié)論:Neuro-2a細(xì)胞株具備Bo NT/A HC入胞的物質(zhì)基礎(chǔ),含有與Bo NT/A HC結(jié)合的高親和力受體(SV2)和低親和力受體(GT1b)的表達(dá),可作為體外細(xì)胞模型用于Bo NT/A HC作用效果的觀察;Bo NT/A HC對Neuro-2a細(xì)胞突起生長具有促進(jìn)作用,但過高濃度的Bo NT/A HC則作用減弱。增加細(xì)胞膜上GT1b的濃度可以增強(qiáng)Bo NT/A HC促細(xì)胞突起生長作用;相反用TVL耗竭細(xì)胞膜上的GT1b后Bo NT/A HC的促突起生長作用減弱或消失。Bo NT/AHC促Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起生長的機(jī)制極有可能是因Bo NT/A HC入胞后激活了細(xì)胞內(nèi)與再生相關(guān)的PI3K/Akt以及MAPK/ERK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：Neuro-2a細(xì)胞 A型肉毒毒素重鏈 神經(jīng)突觸蛋白2 三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂 神經(jīng)生長 神經(jīng)突起生長 Triticum vulgaris Lectin Akt/PKB ERK(extracellularsignal-regulated kinase)
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 Neuro-2a細(xì)胞株用于A型肉毒毒素重鏈體外實(shí)驗(yàn)的可行性研究15-19
• 1 材料與方法15-17
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對象15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-17
• 2 結(jié)果17-19
• 2.1 Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)SV217-18
• 2.2 Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)GT1b18-19
• 第二部分 A型肉毒毒素重鏈對Neuro-2a細(xì)胞突起生長的影響19-28
• 1 材料與方法19-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對象19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• 2 結(jié)果22-28
• 2.1 Bo NT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起的生長22-24
• 2.2 Bo NT/A HC對Akt及ERK1/2 磷酸化的影響24-28
• 第三部分 外源性給予GT1b后增強(qiáng)BoNT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞突起生長作用的研究28-37
• 1 材料與方法28-30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對象28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料28
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 2 結(jié)果30-37
• 2.1 外源性給予GT1b后在Neuro-2a細(xì)胞膜上的表達(dá)情況30
• 2.2 不同處理組Neuro-2a細(xì)胞突起生長情況的形態(tài)學(xué)觀察30-33
• 2.3 不同處理組細(xì)胞內(nèi)再生信號(hào)蛋白磷酸化水平的變化33-37
• 第四部分 TVL拮抗細(xì)胞膜上GT1b對BoNT/A HC促神經(jīng)突起生長作用的影響37-45
• 1 材料與方法37-39
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對象37
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料37
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 2 結(jié)果39-45
• 2.1 TVL對膜GT1b表達(dá)的影響39
• 2.2 TVL處理對Bo NT/A HC促神經(jīng)突起生長作用的影響39-42
• 2.3 TVL對Bo NT/A HC激活細(xì)胞內(nèi)再生信號(hào)蛋白磷酸化的干預(yù)42-45
• 討論45-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述56-70
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-71
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果71-73
• 個(gè)人簡歷73

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