本文關(guān)鍵詞：死亡受體凋亡通路與脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元反應(yīng)的關(guān)系

  更多相關(guān)文章： ADSC 誘導(dǎo)分化反應(yīng) 神經(jīng)元 FAS/FASL TNFR1/TNF-α DR5/TRAIL 細(xì)胞凋亡

【摘要】：目的探討應(yīng)用以β-巰基乙醇為主要成分的誘導(dǎo)劑體外誘導(dǎo)成人脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)分化為神經(jīng)元的反應(yīng)與FAS/FASL、TNFR1/TNF-α、DR5/TRAIL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。為提高誘導(dǎo)反應(yīng)效率、增加誘導(dǎo)后存活細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)其存活時(shí)間提供理論依據(jù),進(jìn)而為神經(jīng)退行性變疾病的細(xì)胞移植提供新的思路與策略。方法1對(duì)吸脂術(shù)后所得的脂肪組織進(jìn)行分離、提取、培養(yǎng)為ADSC。2應(yīng)用β-巰基乙醇為主要成分的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)傳代至第3代的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ADSC,使其向神經(jīng)元方向分化,根據(jù)β-巰基乙醇含量及誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短不同,可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組:未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組。3應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)未誘導(dǎo)組及預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)分化1h、3h、5h、8h組的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neurons specific enolase,NSE),死亡受體及其配體FAS/FASL、TNFR1/TNF-α、DR5/TRAIL,細(xì)胞凋亡因子Caspase 8及Caspase 3的表達(dá)情況。4 Western-blotting法檢測(cè)未誘導(dǎo)組及預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組細(xì)胞的NSE、FAS/FASL、TNFR1/TNF-α、DR5/TRAIL、Caspase 8、Caspase 3的表達(dá)情況。5 MTT法檢測(cè)未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中各組細(xì)胞的存活情況。6應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin/PI雙染法定量檢測(cè)未誘導(dǎo)組及預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)分化1h、3h、5h、8h組的存活細(xì)胞及早期凋亡細(xì)胞的數(shù)量。7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:分別應(yīng)用Excel 2007與SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)中所得所有數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析對(duì)同組間不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較,采用SNK-q檢驗(yàn)的方法對(duì)組間均數(shù)進(jìn)行比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05,以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1由健康青年脂肪組織中提取的ADSC于24h時(shí)已貼壁生長(zhǎng)。貼壁后細(xì)胞開(kāi)始增殖,傳代至(3-5)代時(shí),形態(tài)也逐漸趨于一致,以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主,并呈漩渦狀生長(zhǎng)。2預(yù)誘導(dǎo)組的神經(jīng)元已經(jīng)開(kāi)始分化,突起小且數(shù)量少。正式誘導(dǎo)1h組的細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核開(kāi)始變大且圓,細(xì)胞質(zhì)略有回縮,突起較預(yù)誘導(dǎo)組增長(zhǎng)。誘導(dǎo)3h組的細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)周?chē)杂泄馊?突起結(jié)構(gòu)進(jìn)一步伸長(zhǎng),類(lèi)似于神經(jīng)元軸突樣結(jié)構(gòu),且突起結(jié)構(gòu)數(shù)量略增加,并發(fā)現(xiàn)其交織成網(wǎng)絡(luò)狀。誘導(dǎo)5h組的細(xì)胞折光性進(jìn)一步增強(qiáng),細(xì)胞外可見(jiàn)明顯光暈,一些細(xì)胞突起的末端出現(xiàn)細(xì)小的分支,發(fā)現(xiàn)其與樹(shù)突細(xì)胞結(jié)構(gòu)相類(lèi)似,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)典型。誘導(dǎo)8h組的部分分化細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生退化,突起縮短,且漂浮的死亡細(xì)胞數(shù)量增多。3免疫細(xì)胞化學(xué)法在未誘導(dǎo)組ADSC未檢測(cè)到NSE的陽(yáng)性表達(dá),在預(yù)誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組均有陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)部位主要位于細(xì)胞漿和突起,且誘導(dǎo)5h組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于誘導(dǎo)1h、3h組(P0.05),但與誘導(dǎo)8h組陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。FAS、FASL、TNFR1、TNF-α、DR5、TRAIL在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)反應(yīng)過(guò)程中的各組均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá),且陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)主要在細(xì)胞漿和突起部位,且隨著誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),其表達(dá)水平明顯逐漸升高,其中FAS、FASL的表達(dá)在8h組達(dá)到高峰(P0.05),TNFR1、TNF-α及DR5、TRAIL在5h組最高(P0.05)。Caspase 8的表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在8h達(dá)到高峰(P0.05)。Caspase 3的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在5h進(jìn)入高峰期(P0.05),其中5h組與8h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4應(yīng)用Western-blotting法在未誘導(dǎo)組未檢測(cè)到NSE的陽(yáng)性表達(dá),在誘導(dǎo)第5h組明顯高于1h、3h(P0.05),但與8h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。FAS、FASL、TNFR1、TNF-α、DR5、TRAIL的表達(dá)隨著誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,其中FAS、FASL的表達(dá)在8h組達(dá)到高峰(P0.05),TNFR1、TNF-α及DR5、TRAIL在5h組最高(P0.05)。Caspase 8表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在8h達(dá)到高峰(P0.05)。Caspase 3表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在5h進(jìn)入高峰期(P0.05),其中5h組與8h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5應(yīng)用MTT法檢測(cè)的存活細(xì)胞的吸光度值在未誘導(dǎo)ADSC組,預(yù)誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)1h,3h,5h,8h組逐漸下降。6流式細(xì)胞術(shù)Annexin/PI雙染法的結(jié)果提示,ADSC在誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中,細(xì)胞存活率隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少,細(xì)胞早期凋亡率隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。結(jié)論ADSC分化為神經(jīng)元的過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因之一是死亡受體及其配體系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。其中,TNFR1/TNF-α和DR5/TRAIL通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要在這種誘導(dǎo)反應(yīng)的前5h作用顯著,5h以后則作用明顯減弱。但FAS/FASL途徑引發(fā)的細(xì)胞凋亡在整個(gè)誘導(dǎo)反應(yīng)過(guò)程中均很明顯。
【關(guān)鍵詞】：ADSC 誘導(dǎo)分化反應(yīng) 神經(jīng)元 FAS/FASL TNFR1/TNF-α DR5/TRAIL 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-48
• 1.1 材料與方法13-26
• 1.1.1 材料13-18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-26
• 1.2 結(jié)果26-41
• 1.2.1 ADSC原代培養(yǎng)及傳代后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化特征26-27
• 1.2.2 ADSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化特征27-28
• 1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ADSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中NSE/ FAS/ FASL/ TNFR1/ TNF-α/ DR5/ TRAIL/ Caspase 8 / Caspase 3 的表達(dá)情況28-35
• 1.2.4 ADSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中NSE/ FAS/ FASL/ TNFR1/ TNF-α/ DR5/ TRAIL/ Caspase 8/ Caspase 3 表達(dá)水平的western blotting法檢測(cè)結(jié)果35-39
• 1.2.5 ADSC及ADSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)程中各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的MTT法檢測(cè)結(jié)果39-40
• 1.2.6 ADSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中各組細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)結(jié)果40-41
• 1.3 討論41-44
• 1.4 小結(jié)44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 第2章 綜述死亡受體途徑的研究進(jìn)展48-53
• 2.1 FAS/FASL途徑48-49
• 2.2 TNFR途徑49-50
• 2.3 TRAIL途徑50-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 結(jié)論53-54
• 致謝54-55
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介55-56
• 作者簡(jiǎn)介56-57
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集57

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本文編號(hào)：913458