發(fā)布時(shí)間：2017-09-19 11:08

  本文關(guān)鍵詞：膜聯(lián)蛋白Annexin1對(duì)大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：第一部分膜聯(lián)蛋白Annexin1與腦出血的相關(guān)性研究目的:研究大鼠腦出血(ICH)后血清、腦組織中以及體外ICH模型中膜聯(lián)蛋白Annexin1(ANXA1)在ICH后不同時(shí)間點(diǎn)的變化。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分,隨機(jī)任選42只大鼠分為假手術(shù)組和ICH后6h、12h、24h、48h、72h、1w共7組,每組6只。所有的大鼠在腦出血后相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)被處死。在每組大鼠取血腫周圍1.5-2mm范圍內(nèi)腦組織,利用雙重免疫熒光和Western blot技術(shù)分析檢測(cè)其ANXA1的表達(dá),尾靜脈采血提取血清,利用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)ANXA1水平。在體外實(shí)驗(yàn)中取人類腦血管內(nèi)皮(h CMEC/D3)細(xì)胞依據(jù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分分為7組,利用western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中ANXA1的表達(dá)水平。結(jié)果:1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠腦出血后腦組織中ANXA1表達(dá)下降,以ICH后24h組ANXA1表達(dá)下降最顯著(P0.01);2、大鼠血清的ANXA1表達(dá)在ICH后呈先下降后恢復(fù)的趨勢(shì),在24h ANXA1分泌值達(dá)最低(P0.05);3、體外血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果ANXA1蛋白表達(dá)先下降后恢復(fù),18h下降最明顯(P0.01);4、血清中ANXA1下降水平較腦組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞慢,恢復(fù)也相對(duì)遲緩。結(jié)論:1、ICH后血管內(nèi)皮細(xì)胞ANXA1表達(dá)呈先下降后恢復(fù),在腦組織及血清中ANXA1水平在腦出血24h后達(dá)最低;2、在體外實(shí)驗(yàn)中人類腦血管內(nèi)皮(h CMEC/D3)細(xì)胞ANXA1表達(dá)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似;3、血清中ANXA1的水平,在ICH后下降及恢復(fù)速度相對(duì)腦組織遲緩。第二部分人重組ANXA1在腦出血后血腦屏障損傷誘發(fā)早期腦損傷中的保護(hù)作用目的:探索大鼠尾靜脈注射人重組ANXA1對(duì)大鼠腦出血預(yù)后及血腦屏障保護(hù)作用。方法:在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,任選120只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、腦出血+溶劑組(ICH+vehicle)、腦出血+人重組ANXA1低劑量組(ICH+ANXA1-L)、腦出血+人重組ANXA1中劑量組(ICH+ANXA1-M)、腦出血+人重組ANXA1高劑量組(ICH+ANXA1-H),共計(jì)5組(n=24/組)。在基底節(jié)注射膠原酶3小時(shí)后尾靜脈注射rh ANXA1,腦出血后24小時(shí),所有大鼠放血。每組取6只大鼠腦做切片進(jìn)行TUNEL染色、Fluoro-Jade B(FJB)染色;每組取6只大鼠腦組織進(jìn)行Western Blot分析和免疫共沉淀分析;另外每組取6只大鼠用于伊文思藍(lán)染色檢測(cè)血腦屏障的破壞,而剩下每組6只大鼠每進(jìn)行腦水腫的評(píng)估。結(jié)果:1、TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果,腦出血組較假手術(shù)組凋亡指數(shù)明顯增高。rh ANXA1中高劑量治療組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯改善(P0.01);2、FJB染色陽(yáng)性細(xì)胞在腦出血組較假手術(shù)組明顯增多,rh ANXA1中高劑量干預(yù)后FJB陽(yáng)性細(xì)胞明顯下降(P0.01);3、高劑量組對(duì)誘導(dǎo)閉合蛋白和閉鎖小帶-1(ZO-1)蛋白水平上調(diào)有重要作用(P0.01);4、rh ANXA1在腦出血后干預(yù),血管中外滲到腦組織的伊文思藍(lán)染料明顯減少(P0.01)。中高劑量的rh ANXA1能夠改善ICH后白蛋白的外滲(P0.05)。最后,腦水含量在高劑量組明顯比低劑量組腦水含量低(P0.01)。結(jié)論:通過(guò)提高腦出血后ANXA1的水平,能夠改善腦出血預(yù)后和維護(hù)血腦屏障的完整性。第三部分膜聯(lián)蛋白Annexin 1對(duì)大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究目的:通過(guò)小干擾RNA和定點(diǎn)突變技術(shù)研究ANXA1潛在的保護(hù)作用機(jī)制。方法:1、通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)分析ANXA1與β-肌動(dòng)蛋白/FPR2受體之間作用在假手術(shù)組和ICH治療組中的不同。2、使用免疫共沉淀方法,通過(guò)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞野生型和突變體的ANXA1磷酸化情況。3、篩選干擾效果最佳的si RNA進(jìn)行干擾ANXA1的表達(dá),檢測(cè)干擾后或點(diǎn)突變后的內(nèi)皮細(xì)胞滲透性。4、利用免疫熒光的方法檢測(cè)F-肌動(dòng)蛋白與ANXA1的分布關(guān)系,在氧合血紅蛋白作用下的變化。5、通過(guò)免疫共沉淀的方法驗(yàn)證ANXA1與FPR2相互作用關(guān)系,以及對(duì)ANXA1的分泌影響。結(jié)果:1、ICH誘導(dǎo)ANXA1磷酸化,尤其在絲氨酸-27和蘇氨酸-24;2、ANXA1對(duì)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性作用依賴磷酸化;3、ANXA1蘇氨酸-24殘基磷酸化破壞損害ANXA1形成β-肌動(dòng)蛋白;4、ANXA1絲氨酸-27殘基破壞將影響與FPR2蛋白相互作用,進(jìn)而影響ANXA1分泌。結(jié)論:通過(guò)ANXA1的蘇氨酸-24和絲氨酸-27的磷酸化可以防止腦出血后引發(fā)的血腦屏障功能障礙。在腦出血后ANXA1的磷酸化是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種可能的自我修復(fù)策略。
【關(guān)鍵詞】：腦出血 ANXA1 腦出血 血腦屏障 FJB染色 TUNEL染色 腦水腫 腦出血 β-肌動(dòng)蛋白/FRP2膜蛋白受體 磷酸化 siRNA 定點(diǎn)突變
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.34
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 前言13-17
• 參考文獻(xiàn)15-17
• 第一部分 膜聯(lián)蛋白A1與腦出血的相關(guān)性研究17-32
• 材料和方法17-25
• 結(jié)果25-28
• 討論28-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 第二部分 人重組ANXA1在腦出血后血腦屏障損傷誘發(fā)早期腦損傷中的保護(hù)作用32-55
• 材料和方法32-44
• 結(jié)果44-51
• 討論51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 第三部分 膜聯(lián)蛋白A1對(duì)大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究55-76
• 材料和方法56-65
• 結(jié)果65-69
• 討論69-72
• 結(jié)論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-76
• 綜述76-81
• 參考文獻(xiàn)79-81
• 中英文縮略詞表81-82
• 攻讀碩士期間公開(kāi)發(fā)表的論文82-83
• 致謝83-85

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本文編號(hào)：881280