本文關鍵詞：膜聯(lián)蛋白Annexin1對大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護作用機制的實驗研究

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【摘要】：第一部分膜聯(lián)蛋白Annexin1與腦出血的相關性研究目的:研究大鼠腦出血(ICH)后血清、腦組織中以及體外ICH模型中膜聯(lián)蛋白Annexin1(ANXA1)在ICH后不同時間點的變化。方法:體內(nèi)實驗部分,隨機任選42只大鼠分為假手術組和ICH后6h、12h、24h、48h、72h、1w共7組,每組6只。所有的大鼠在腦出血后相應的時間點被處死。在每組大鼠取血腫周圍1.5-2mm范圍內(nèi)腦組織,利用雙重免疫熒光和Western blot技術分析檢測其ANXA1的表達,尾靜脈采血提取血清,利用酶聯(lián)免疫技術檢測ANXA1水平。在體外實驗中取人類腦血管內(nèi)皮(h CMEC/D3)細胞依據(jù)體內(nèi)實驗部分分為7組,利用western blot檢測內(nèi)皮細胞中ANXA1的表達水平。結果:1、體內(nèi)實驗結果表明,大鼠腦出血后腦組織中ANXA1表達下降,以ICH后24h組ANXA1表達下降最顯著(P0.01);2、大鼠血清的ANXA1表達在ICH后呈先下降后恢復的趨勢,在24h ANXA1分泌值達最低(P0.05);3、體外血管內(nèi)皮細胞實驗結果ANXA1蛋白表達先下降后恢復,18h下降最明顯(P0.01);4、血清中ANXA1下降水平較腦組織及血管內(nèi)皮細胞慢,恢復也相對遲緩。結論:1、ICH后血管內(nèi)皮細胞ANXA1表達呈先下降后恢復,在腦組織及血清中ANXA1水平在腦出血24h后達最低;2、在體外實驗中人類腦血管內(nèi)皮(h CMEC/D3)細胞ANXA1表達與體內(nèi)實驗結果類似;3、血清中ANXA1的水平,在ICH后下降及恢復速度相對腦組織遲緩。第二部分人重組ANXA1在腦出血后血腦屏障損傷誘發(fā)早期腦損傷中的保護作用目的:探索大鼠尾靜脈注射人重組ANXA1對大鼠腦出血預后及血腦屏障保護作用。方法:在體內(nèi)實驗中,任選120只,隨機分為假手術組(sham)、腦出血+溶劑組(ICH+vehicle)、腦出血+人重組ANXA1低劑量組(ICH+ANXA1-L)、腦出血+人重組ANXA1中劑量組(ICH+ANXA1-M)、腦出血+人重組ANXA1高劑量組(ICH+ANXA1-H),共計5組(n=24/組)。在基底節(jié)注射膠原酶3小時后尾靜脈注射rh ANXA1,腦出血后24小時,所有大鼠放血。每組取6只大鼠腦做切片進行TUNEL染色、Fluoro-Jade B(FJB)染色;每組取6只大鼠腦組織進行Western Blot分析和免疫共沉淀分析;另外每組取6只大鼠用于伊文思藍染色檢測血腦屏障的破壞,而剩下每組6只大鼠每進行腦水腫的評估。結果:1、TUNEL染色實驗結果,腦出血組較假手術組凋亡指數(shù)明顯增高。rh ANXA1中高劑量治療組血管內(nèi)皮細胞凋亡明顯改善(P0.01);2、FJB染色陽性細胞在腦出血組較假手術組明顯增多,rh ANXA1中高劑量干預后FJB陽性細胞明顯下降(P0.01);3、高劑量組對誘導閉合蛋白和閉鎖小帶-1(ZO-1)蛋白水平上調(diào)有重要作用(P0.01);4、rh ANXA1在腦出血后干預,血管中外滲到腦組織的伊文思藍染料明顯減少(P0.01)。中高劑量的rh ANXA1能夠改善ICH后白蛋白的外滲(P0.05)。最后,腦水含量在高劑量組明顯比低劑量組腦水含量低(P0.01)。結論:通過提高腦出血后ANXA1的水平,能夠改善腦出血預后和維護血腦屏障的完整性。第三部分膜聯(lián)蛋白Annexin 1對大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護作用機制的實驗研究目的:通過小干擾RNA和定點突變技術研究ANXA1潛在的保護作用機制。方法:1、通過免疫共沉淀實驗來分析ANXA1與β-肌動蛋白/FPR2受體之間作用在假手術組和ICH治療組中的不同。2、使用免疫共沉淀方法,通過檢測血管內(nèi)皮細胞野生型和突變體的ANXA1磷酸化情況。3、篩選干擾效果最佳的si RNA進行干擾ANXA1的表達,檢測干擾后或點突變后的內(nèi)皮細胞滲透性。4、利用免疫熒光的方法檢測F-肌動蛋白與ANXA1的分布關系,在氧合血紅蛋白作用下的變化。5、通過免疫共沉淀的方法驗證ANXA1與FPR2相互作用關系,以及對ANXA1的分泌影響。結果:1、ICH誘導ANXA1磷酸化,尤其在絲氨酸-27和蘇氨酸-24;2、ANXA1對腦毛細血管內(nèi)皮細胞的滲透性作用依賴磷酸化;3、ANXA1蘇氨酸-24殘基磷酸化破壞損害ANXA1形成β-肌動蛋白;4、ANXA1絲氨酸-27殘基破壞將影響與FPR2蛋白相互作用,進而影響ANXA1分泌。結論:通過ANXA1的蘇氨酸-24和絲氨酸-27的磷酸化可以防止腦出血后引發(fā)的血腦屏障功能障礙。在腦出血后ANXA1的磷酸化是腦血管內(nèi)皮細胞的一種可能的自我修復策略。
【關鍵詞】：腦出血 ANXA1 腦出血 血腦屏障 FJB染色 TUNEL染色 腦水腫 腦出血 β-肌動蛋白/FRP2膜蛋白受體 磷酸化 siRNA 定點突變
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.34
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 前言13-17
• 參考文獻15-17
• 第一部分 膜聯(lián)蛋白A1與腦出血的相關性研究17-32
• 材料和方法17-25
• 結果25-28
• 討論28-29
• 結論29-30
• 參考文獻30-32
• 第二部分 人重組ANXA1在腦出血后血腦屏障損傷誘發(fā)早期腦損傷中的保護作用32-55
• 材料和方法32-44
• 結果44-51
• 討論51-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-55
• 第三部分 膜聯(lián)蛋白A1對大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護作用機制的實驗研究55-76
• 材料和方法56-65
• 結果65-69
• 討論69-72
• 結論72-73
• 參考文獻73-76
• 綜述76-81
• 參考文獻79-81
• 中英文縮略詞表81-82
• 攻讀碩士期間公開發(fā)表的論文82-83
• 致謝83-85

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本文編號：881280