發(fā)布時間：2017-09-19 06:10

  本文關鍵詞：帕金森病模型大鼠腳橋核與皮層—基底節(jié)環(huán)路β振蕩網(wǎng)絡的研究

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【摘要】：研究背景：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元的變性死亡、紋狀體DA含量顯著性減少,從而導致肢體震顫、肌肉僵直和運動遲緩等三大運動性癥狀。PD早期以左旋多巴等藥物治療效果較好,當藥物療效逐漸下降、出現(xiàn)嚴重副作用以及異動癥等并發(fā)癥時,可考慮手術治療作為藥物治療的一種有效補充,腦深部電刺激術(deep brain stimulation, DBS)是目前PD外科治療的首選方案,以丘腦底核(subthalamic nucleus, STN)為刺激靶點的DBS治療能全面改善PD的三大臨床癥狀,同時也能減少藥物用量。然而,當病程進展到中晚期時,半數(shù)以上PD患者可出現(xiàn)姿勢不穩(wěn)和步態(tài)障礙(Postural instability and Gait disorder, PIGD)的中軸癥狀(axial symptoms),可表現(xiàn)為頻繁跌倒、慌張步態(tài)、凍結(jié)步態(tài)(freezing of gait, FOG)等,并隨病程進展,癥狀逐漸加重。不管是左旋多巴等藥物治療,還是以STN等為刺激靶點的DBS治療,均不能有效地改善這些嚴重影響PD患者生活質(zhì)量的中軸癥狀,使之成為晚期PD患者臨床治療的一個難題,是導致患者致殘的主要原因。近年來,臨床研究和非人靈長類動物實驗發(fā)現(xiàn)腳橋核(pedunculopontine nucleus, PPN)的功能失調(diào)可能與晚期PD患者中軸癥狀的產(chǎn)生具有較為密切的聯(lián)系,并且研究還發(fā)現(xiàn)低頻電刺激PPN可有效改善晚期PD的中軸癥狀,PPN有望成為應用于臨床治療晚期PD姿勢和步態(tài)障礙的潛在靶點,引起越來越多的學者重視。因此,對PPN的生理功能及其在帕金森病中病理生理改變的研究,將有助于闡明中軸癥狀的發(fā)生機制以及PPN-DBS的作用機制。神經(jīng)電生理學記錄和分析的方法是研究PD的病理生理學改變和DBS具體作用機制的重要方法。近年來,局部場電位(local field potential, LFP)的電生理學記錄方法逐漸被研究者們重新重視起來,被越來越多地應用于研究帕金森病及其他運動障礙性疾病的病理生理學機制。局部場電位是一種振蕩性的電活動(oscillatory activity),反映局部區(qū)域一群神經(jīng)元以及突觸結(jié)構(gòu)等的綜合電位變化或同步性電活動結(jié)果。與腦電(EEG)類似,可根據(jù)振蕩的頻率分為幾個特定頻段：δ頻段(1-3Hz)、θ頻段(4-7Hz)、α頻段(8-13Hz)、β頻段(14-30Hz)、γ頻段(30Hz)。研究者們已經(jīng)在PD皮層-基底節(jié)環(huán)路記錄到了許多不同頻段的振蕩電活動,其中最重要的是β頻段振蕩電活動,目前被大多數(shù)研究者認為是帕金森病電生理學方面的一個重要特征,是一種病理性的電活動,具有抵抗運動或抑制運動的效應(anti-kinetic effects),從而導致PD運動遲緩等臨床運動癥狀的產(chǎn)生。近幾年,許多研究者對實施了PPN-DBS手術的PD患者進行了電生理記錄,利用手術植入PPN的刺激電極記錄了PPN的局部場電位,以此來研究PPN中的振蕩性電活動,也發(fā)現(xiàn)了幾種頻段的振蕩電活動,包括：(1)可能是PPN中一種重要的生理性振蕩電活動并在PD中出現(xiàn)病理性減少的α頻段振蕩電活動；(2)對其性質(zhì)尚存爭議的β頻段振蕩電活動,多數(shù)認為可能和基底節(jié)中的β振蕩一樣,具有anti-kinetic的作用,但也有Tsang等人得到不一致的研究結(jié)果,因此對于PPN中的β振蕩電活動有待進一步研究。(3)θ頻段和γ頻段的振蕩電活動。θ振蕩可能參與了運動時PPN和感覺運動皮層之間的感覺信息的反饋過程,γ振蕩可能和β振蕩類似,也是一種病理性的電活動,這些均有待進一步的研究。雖然臨床研究獲得了一些重要的結(jié)果,但是這些臨床研究只能利用實施過PPN-DBS手術的病人進行研究,而目前接受PPN-DBS手術治療的病例數(shù)量有限,并且缺乏正常狀態(tài)的數(shù)據(jù)對比,同時難以和其他核團或腦區(qū)聯(lián)系起來進行更深入的分析,所以需要動物實驗進行有效補充和深入研究,促進對PD中軸癥狀發(fā)生機制以及PPN-DBS作用機制的理解。目的：本研究使用Cerebus多通道神經(jīng)信號記錄系統(tǒng)同步記錄6-OHDA誘導的PD模型大鼠PPN、初級運動皮層(primary motor cortex, M1)和STN三個部位的局部場電位,并對這些部位的電活動進行功率譜密度、相干性以及格蘭杰因果分析,從而實現(xiàn)以下三個研究目的：(1)記錄研究PD模型大鼠PPN中的振蕩性電活動；(2)研究PPN的振蕩性電活動和皮層-基底節(jié)環(huán)路的振蕩性電活動之間的關系；(3)研究左旋多巴藥物對PPN和皮層-基底節(jié)環(huán)路的振蕩性電活動的影響。方法：1、實驗分組本實驗選用健康成年的無特定病原體(Specified pathogen free, SPF)級雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat) 30只。隨機分為三組：(1)假損毀組(n=10),右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)縱束(medial forebrain bundle, MFB)立體定向注射4μl生理鹽水；(2)損毀組(n=13),右側(cè)MFB立體定向注射4μ1 6-OHDA溶液(3μg/μl),損毀黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神經(jīng)元；(3)損毀+左旋多巴組(n=7),右側(cè)MFB立體定向注射4μ1 6-OHDA溶液(3μg/μl),并且接受左旋多巴藥物治療。2、實驗流程(1)所有大鼠在多通道電極植入手術前適應性飼養(yǎng)一周,并進行轉(zhuǎn)棒行為學訓練,轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速6圈／分鐘,每天訓練3次,每次讓大鼠靜止站立于轉(zhuǎn)棒上5分鐘,接著在轉(zhuǎn)棒上行走5分鐘；(2)對所有大鼠進行多通道記錄電極植入手術,同時損毀組和損毀+左旋多巴組在腦內(nèi)注射6-OHDA制作PD大鼠模型,假損毀組注射等量生理鹽水；(3)術后休息恢復一周后,再次進行轉(zhuǎn)棒行為學訓練,操作同前；(4)術后兩周進行阿撲嗎啡旋轉(zhuǎn)測試,初步評估造模效果；(5)術后三周開始進行電生理記錄采集數(shù)據(jù)；(6)數(shù)據(jù)收集完畢后,處死大鼠進行組織學檢測。3、模型的制作和記錄電極的植入所有大鼠戊巴比妥鈉腹腔麻醉,固定于立體定向儀。青霉素腹腔注射預防感染。根據(jù)Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》,以前囟為參考點,計算右側(cè)MFB以及右側(cè)M1、STN、PPN的坐標,在顱骨上標記(MFB：前囟后1.8mm,中線旁開2.0mm,深度顱骨下8.3mm；M1：前囟前1.0mm,中線旁開2.3mm,顱骨下2.0mm; STN:前囟后3.5mm,中線旁開2.5mm,顱骨下8.2mm；PPN:前囟后7.8mm,中線旁開2.0mm,顱骨下7.2mm)。高速渦輪牙鉆在各標記點鉆孔至硬腦膜,MFB處骨窗0.5mm, M1、STN、PPN處骨窗1.0mm,安裝6個錨定螺釘,貼至硬腦膜,固定和連接電極地線。用10μl微量注射器在損毀組和損毀+左旋多巴組大鼠右側(cè)MFB注入新鮮配制的含0.02%維生素C的6-OHDA溶液(12μg/4μ1),假損毀組右側(cè)MFB注入4μl含0.02%維生素C的生理鹽水。顯微鏡下去除M1、STN、PPN骨窗內(nèi)的硬腦膜,依次在三個部位植入8導不銹鋼微絲電極。吸干顱骨表面液體,牙托水泥固定電極絲,覆蓋全部顱骨并制作成電極連接的平臺。4、神經(jīng)電信號數(shù)據(jù)采集所有大鼠在手術后三周開始進行M1、STN、PPN的局部場電位數(shù)據(jù)的采集,分別記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒儀上靜止和行走兩種行為狀態(tài)下的電活動。微電極陣列的接口與headstages連接,使大鼠平穩(wěn)站立在轉(zhuǎn)棒上,適應片刻后保持靜止,記錄5分鐘靜止狀態(tài)下的局部場電位,接著調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)速至6圈/分鐘,再記錄5分鐘行走狀態(tài)下的局部場電位。每只大鼠一共記錄6次5分鐘靜止和5分鐘行走狀態(tài)下的局部場電位。記錄電活動的同時使用攝像頭錄像監(jiān)測和記錄大鼠的行為,以備后續(xù)分析。采集局部場電位時,以地線作參考,采樣率10 KHz,放大倍數(shù)300×,帶通濾波0.3-500 Hz。所有大鼠記錄6次完畢后,損毀+左旋多巴組大鼠給予腹腔注射左旋多巴(5 mg/Kg)和芐絲肼(15mg/Kg),給藥20分鐘后開始記錄局部場電位,操作同上,每只大鼠記錄6次給藥后5分鐘靜止和5分鐘行走狀態(tài)下的局部場電位。5、組織學所有大鼠記錄完畢后腹腔麻醉,電極連接電毀損儀通以陽極直流電,使電極尖端涌出鐵離子,與亞鐵氰化鉀生成藍色絡合物定位電極尖端。開胸心臟灌注生理鹽水,直至肝臟顏色變白,換成含5%亞鐵氰化鉀的4%多聚甲醛溶液,量約400m1/只。斷頭取腦多聚甲醛外固定24小時,25%和30%蔗糖脫水,包埋劑包埋-80℃冰箱快速冷凍。切片時,先冠狀位修整腦組織平面,參照Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定M1、STN、SNc、PPN的位置,在接近各確定部位時作連續(xù)冠狀切片,每隔3張切片保留2張,M1、STN、PPN三個部位片厚40pm, SNc處片厚25pm。 SNc處的切片進行TH免疫組化染色確定多巴胺能神經(jīng)元損毀情況,M1、STN、PPN的切片進行尼氏染色確定電極尖端的位置。6、局部場電位數(shù)據(jù)分析本實驗對局部場電位的分析包括三個方面：功率譜密度(Power spectral density)。相干性(Coherence)。格蘭杰因果分析(Granger causality analysis) 。分析之前需要對數(shù)據(jù)進行初步篩選,根據(jù)組織切片染色結(jié)果,剔除電極尖端不在目標腦區(qū)或核團所屬范圍的大鼠。每只大鼠每個腦區(qū)或核團選取1-2根微電極絲所采集的噪音較少的數(shù)據(jù),每種行為狀態(tài)(靜止或行走)選取120秒無明顯噪音、偽跡的時間段進行計算。(1)功率譜密度功率譜密度是從頻域的角度,對信號及其強度進行解析的一種分析方法。本實驗使用MATLAB工具包Chronux對局部場電位進行功率譜密度的計算,Chronux采用的是一種多抽頭的譜估計方法(multi-taper spectral estimation)。先對局部場電位的數(shù)據(jù)降低采樣率,重新采樣到1000Hz,將120秒數(shù)據(jù)均勻分割成120小段,每段1秒作為一個計算單位,對數(shù)據(jù)進行去除慢漂和50Hz工頻干擾的處理后,進行計算并將所得結(jié)果進行平均。計算時Chronux中的重要參數(shù)設置如下：params.fpass= [0 100](所計算的頻段范圍是0-100Hz)；params.tapers = [3 5](為達到最好的平滑度time-bandwidth設置為3,tapers設置為5)；頻率分辨率為1Hz。每只大鼠分別計算靜止和行走兩種行為狀態(tài)下M1、STN、PPN三個部位記錄的局部場電位的功率譜密度。(2)相干性相干性分析是常被用于評估不同腦區(qū)之間功能關系的一種分析方法,是對兩個信號之間線性相關關系的一種標準估量。相干性的取值為從0到1,0代表兩個信號無線性相關；1代表兩個信號具有極好的線性相關。如果不同腦區(qū)的信號具有較強的相干性,則說明腦區(qū)之間存在著一定的功能聯(lián)系。繼續(xù)使用MATLAB工具包Chronux進行相干性的計算。同樣對局部場電位的數(shù)據(jù)降低采樣率,重新采樣到1000Hz,將120秒數(shù)據(jù)均勻分割成120小段,每段1秒作為一個計算單位,對數(shù)據(jù)進行去除隉漂和50Hz工頻干擾的處理后,進行計算并將所得結(jié)果進行平均。計算時Chronux中的重要參數(shù)設置如下:params.fpass = [0100](所計算的頻段范圍是0-100Hz)；params.tapers = [7 13](為達到最好的平滑度將time-bandwidth設置為7,tapers設置為13)；頻率分辨率為1Hz。每只大鼠分別計算兩種行為狀態(tài)下(靜止和行走)M1、STN、PPN三個部位記錄的局部場電位兩兩之間的相干性(即cohM1-STN、cohM1-PPN、cohSTN-PPN)。(3)格蘭杰因果分析通過計算相干性可以得知不同腦區(qū)之間是否存在功能聯(lián)系,但不同腦區(qū)之間的信息是如何流動的仍然無法判定,因此需要進一步進行因果分析。本實驗通過計算頻域上的偏相關格蘭杰因果系數(shù)(partial Granger causality in the frequency domain)進一步分析M1、STN、PPN三個部位記錄的局部場電位之間的因果聯(lián)系。格蘭杰因果分析是常被用于判斷一個時間序列是否能預測另一個時間序列的一種分析方法。如果一個觀測到的時間序列x(n)過去的信息能夠顯著提高對另一個時間序列y(n)的預測性,則可以說信號x(n) Granger-causes信號y(n),,即兩個信號之間存在因果關系,信號x(n)是因,信號y(n)是果。如果需要分析的信號或者記錄的部位多于兩個時,則需要使用偏相關格蘭杰因果分析。在分析其中某兩個信號的因果關系時,需要把其他信號的影響也考慮進來。本實驗使用MATLAB軟件采用多變量自回歸模型(multivariate autoregressive modeling)的方法來計算partial Granger causality。主要步驟為：第一步是model order的估計,最佳model order通過Akaike Information Criterion(AIC)選出；第二步是Vector AutoRegressive (VAR) model的估計,使用第一步得到的model order通過the Levinson, Wiggins and Robinson (LWR) algorithm計算獲得VAR model;第三步通過第二步的VAR model計算得到autocovariance sequence;最后通過autocovariance sequence計算獲得partial Granger causality 。7、統(tǒng)計學采用SPSS20.0、MATLAB和GraphadPad prism 5.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。假損毀組和損毀組大鼠功率譜密度的差異以及相干性的差異需要在0-100Hz上逐個頻率點進行比較,為解決多重比較問題,本實驗采用cluster-based, nonparametric permutation t-tests (n = 1,000 permutations, corrected for multiple comparisons)的方法進行統(tǒng)計檢驗,每個頻率點的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤表示。β頻段的功率譜、相干性和格蘭杰因果系數(shù)在假損毀組、損毀組和損毀+左旋多巴組之間的比較均采用Kruskal-Wallis test及Dunn's Multiple Comparison Test post hoc的統(tǒng)計檢驗方法。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：1、損毀黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元后功率譜密度的變化在大鼠行走運動時,損毀組大鼠三個部位的β頻段功率均較假損毀組顯著增高,但各自增高的頻段范圍不完全一致,M1為15-24 Hz (P=0.042), STN為13-28 Hz(P=0.014),PPN為14-22 Hz(P=0.035)。在大鼠靜止時,損毀組大鼠M1的β頻段功率較假損毀組顯著增高,頻率范圍為21-35 Hz(P=0.042),而靜止時兩組大鼠STN、PPN的功率譜密度在0-100Hz上均未見顯著差異(P0.05)。2、損毀黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元后對相干性的影響在大鼠行走運動時,損毀組大鼠三個部位兩兩之間β頻段的相干性均較假損毀組顯著增高,M1-STN為10-34 Hz (P = 0.004), M1-PPN為11-36 Hz (P = 0.006), STN-PPN為14-28 Hz(P=0.01)。在大鼠靜止時,兩組大鼠三個部位各自之間的相干性在0-100Hz上均未見顯著差異(P0.05)。3、多巴胺能藥物治療對p頻段功率譜密度和相干性的影響帕金森病模型大鼠在接受左旋多巴治療后,原本在β頻段增加的功率譜密度和相干性均降低到正常水平(P0.05)。4、p振蕩電活動格蘭杰因果分析結(jié)果格蘭杰因果分析結(jié)果顯示,在STN→M1(P 0.001)、STN→PPN(P 0.001)和PPN→M1(P 0.001)三個方向上,6-OHDA損毀組的p頻段格蘭杰因果系數(shù)顯著高于假損毀組和損毀+左旋多巴組；而在各自的反方向上(M1→STN、 PPN→STN、M1→PPN),三組的p頻段格蘭杰因果系數(shù)沒有顯著差異(P0.05)。這說明p振蕩電活動在Ml、STN、PPN三個部位之間的流動方向是STN →M1→STN→PPN和PPN→M1;并且多巴胺能藥物(左旋多巴)治療后,STN→M1→STN→PPN和PPN→M1三個方向上的p頻段格蘭杰因果系數(shù)降低到正常水平。結(jié)論：1、本實驗在帕金森病模型大鼠行走時記錄到了在M1、STN和PPN三個部位增強的p頻段振蕩電活動,是首次在6-OHDA帕金森病模型大鼠PPN記錄到增強的p振蕩電活動的研究。且PPN中記錄到的p振蕩電活動很有可能來自于基底節(jié)中的STN。2、根據(jù)格蘭杰因果分析,增強的p振蕩電活動在M1、STN、PPN三個部位之間的流動方向是STN→M1、STN→PPN和PPN→M1。其中,STN在這個p振蕩的網(wǎng)絡中起著主導性作用,STN可能是帕金森病中異常p振蕩電活動的源頭。3、雖然左旋多巴藥物能抑制PPN增強的β振蕩電活動,卻不能緩解帕金森病患者步態(tài)和姿勢障礙的中軸癥狀,因此,β振蕩電活動可能并不是導致帕金森病人中軸癥狀的主要病理生理電活動基礎。
【關鍵詞】：帕金森病 局部場電位 功率譜密度 相干性 格蘭杰因果分析
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5;R-332
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-22
• 第一章 前言22-29
• 第二章 材料與方法29-42
• 2.1 實驗材料29-33
• 2.2 實驗方法33-42
• 第三章 結(jié)果42-54
• 3.1 大鼠的剔除情況42
• 3.2 免疫組織化學染色結(jié)果42-43
• 3.3 尼氏染色結(jié)果43-44
• 3.4 局部場電位數(shù)據(jù)分析結(jié)果44-54
• 第四章 討論54-59
• 4.1 PPN中β頻段振蕩電活動的分析54-55
• 4.2 β頻段振蕩電活動環(huán)路及來源的分析55-57
• 4.3 多巴胺能藥物對β頻段振蕩電活動影響的分析57-59
• 第五章 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-65
• 綜述65-81
• References75-81
• 中英文縮略詞對照表81-82
• 攻讀學位期間成果82-83
• 致謝83-85

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本文編號：879947