本文關(guān)鍵詞：低氧誘導(dǎo)因子HIF3α在神經(jīng)管畸形中的表達(dá)及作用分析

  更多相關(guān)文章： 維甲酸 神經(jīng)管畸形 HIF3α BNIP3 細(xì)胞凋亡

【摘要】：目的:探討低氧誘導(dǎo)因子在神經(jīng)管畸形中的作用及其可能的機(jī)制。首先使用維甲酸建立神經(jīng)管畸形(NTDs)動(dòng)物模型,取NTDs胚胎腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,經(jīng)過生物信息學(xué)分析后得到低氧誘導(dǎo)因子HIF3α與基因BNIP3表達(dá)發(fā)生變化,所以將其作為本次實(shí)驗(yàn)的主要研究靶點(diǎn)。其次,通過使用維甲酸體外干預(yù)PC12細(xì)胞,在細(xì)胞水平探討靶基因HIF3a與BNIP3以及細(xì)胞凋亡之間的相互關(guān)系,進(jìn)而揭示其在神經(jīng)管畸形發(fā)生發(fā)展過程中的作用和可能的機(jī)制。方法:1.在C57BL/6J小鼠懷孕7.5天(E7.5)時(shí)通過灌胃將一定量的維甲酸注入小鼠體內(nèi),造成胚胎神經(jīng)管畸形(NTDs)的模型;造模成功后取E10.5天胚胎腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)管畸形的形成過程中低氧誘導(dǎo)因子HIF1a、HIF3a及相關(guān)下游基因BNIP3的表達(dá)發(fā)生了改變。2.通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)Real-time PCR檢測(cè)胚胎腦組織中HIF1a、HIF3a、BNIP3 mRN A表達(dá)情況,即對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。3.在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證,通過使用不同濃度維甲酸(0μM、20μM、40μM)在體外對(duì)PC12細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng),采用Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)變化;4.為研究靶基因變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,使用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)不同濃度維甲酸干預(yù)后細(xì)胞的凋亡情況、產(chǎn)生活性氧的變化以及細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況;5.為進(jìn)一步研究HIF3a和BNIP3以及細(xì)胞凋亡機(jī)制之間的相互關(guān)系,通過使用脂質(zhì)體將化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)PC12細(xì)胞干擾HIF3α的表達(dá),抑制了HIF3α表達(dá)后,將細(xì)胞分為四組,即正常對(duì)照組、維甲酸干預(yù)組,HIF3αsiRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染組和hif3αsirna細(xì)胞轉(zhuǎn)染后再加維甲酸干預(yù)組,采用real-timepcr和westernblotting檢測(cè)分析bnip3的表達(dá)變化;6.使用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)四組細(xì)胞的凋亡情況;7.對(duì)四組細(xì)胞進(jìn)行活化的caspase3染色,在熒光顯微鏡下觀察各組caspase3的激活情況。結(jié)果:1.使用21mg/kg劑量的維甲酸,小鼠胚胎神經(jīng)管畸形造模成功,對(duì)照組胚胎整體形態(tài)完整,輪廓、體節(jié)清晰,體積較大,腦部充盈飽滿,畸形組胚胎體積較小,體節(jié)不明顯,常有腦部發(fā)育不足或腦膨出,測(cè)序分析得到畸形組低氧誘導(dǎo)因子hif1a表達(dá)下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,hif3a、bnip3表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2.real-timepcr檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,畸形組低氧誘導(dǎo)因子hif1α表達(dá)下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,hif3α、bnip3表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測(cè)hif3a、bnip3可能與ntds的有關(guān);3.在細(xì)胞水平上,通過real-timepcr和westernblotting的結(jié)果分析得到,細(xì)胞中hif3α、bnip3隨著使用維甲酸劑量的加大表達(dá)升高,與體內(nèi)組織中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。4.流式的細(xì)胞分析結(jié)果顯示,使用維甲酸的劑量越大,細(xì)胞凋亡越多,產(chǎn)生的活性氧越多,細(xì)胞線粒體膜電位越低,表明維甲酸可能是通過上調(diào)靶基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染sirna進(jìn)pc12細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率一般為70%左右,干擾hif3α的表達(dá)抑制了bnip3的表達(dá)以及維甲酸誘導(dǎo)的bnip3表達(dá)的升高;6.流式結(jié)果顯示,干擾hif3α的表達(dá)抑制了維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,由此說明,維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過hif3α調(diào)控bnip3實(shí)現(xiàn)的。7.維甲酸能夠激活caspase3,干擾hif3α能在一定程度上抑制對(duì)caspase3的活化。結(jié)論:維甲酸誘導(dǎo)HIF3α、BNIP3表達(dá)升高并激活caspase3,HIF3α通過調(diào)控BNIP3的表達(dá)從而影響細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：維甲酸 神經(jīng)管畸形 HIF3α BNIP3 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R748
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用縮寫詞中英文對(duì)照表12-14
• 前言14-16
• 第一章 HIF3α、BNIP3在神經(jīng)管畸形中表達(dá)的初步分析及驗(yàn)證16-27
• 1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑16
• 1.3 主要儀器和器材16-17
• 1.4 試劑配制17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-20
• 2.1 動(dòng)物神經(jīng)管畸形模型的建立17-18
• 2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序18
• 2.3 Real-time PCR驗(yàn)證胚胎腦組織中HIF1a、HIF3a、BNIP3的表達(dá)水平18-20
• 2.4 統(tǒng)計(jì)方法20
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-25
• 3.1 神經(jīng)管畸形模型的建立20-21
• 3.2 測(cè)序結(jié)果21-22
• 3.3 Real-time PCR驗(yàn)證胚胎腦組織中HIF1a、HIF3a、BNIP3表達(dá)情況22-25
• 4 討論25-27
• 第二章 低氧誘導(dǎo)因子HIF3α 通過調(diào)控BNIP3引起PC12細(xì)胞凋亡27-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑27-28
• 1.2 主要儀器和器材28-29
• 1.3 試劑配制29
• 2 實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)29-30
• 2.2 維甲酸干預(yù)細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡30-32
• 2.3 HIF3α、BNIP3隨加入維甲酸濃度的增加表達(dá)增高32-34
• 2.4 HIF3αsiRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染34-35
• 2.5 HIF3α siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，，BNIP3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡的測(cè)定35-36
• 2.6 統(tǒng)計(jì)方法36
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-50
• 3.1 不同濃度維甲酸干預(yù)細(xì)胞36-37
• 3.2 HIF3α、BNIP3在維甲酸干預(yù)后的PC12細(xì)胞中表達(dá)的研究37-39
• 3.3 維甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡39-40
• 3.4 維甲酸誘導(dǎo)使細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧含量增高40-41
• 3.5 維甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位降低41-43
• 3.6 HIF3αsiRN A細(xì)胞轉(zhuǎn)染43-45
• 3.7 HIF3α 干擾后抑制了BNIP3在PC12細(xì)胞中的表達(dá)45-46
• 3.8 HIF3α 干擾后抑制了維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡46-48
• 3.9 HIF3α 干擾后抑制了維甲酸對(duì)caspase3的活化48-50
• 3.10 總結(jié)50
• 4 討論50-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 綜述57-69
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 致謝69-70
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果70-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

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本文編號(hào)：864167