本文關(guān)鍵詞：低劑量輻射對人膠質(zhì)瘤細胞增殖的刺激作用及其Wnt信號機制的研究

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【摘要】：研究背景與研究目的膠質(zhì)瘤(Glioma)是發(fā)病率最高的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,目前主要臨床治療手段包括手術(shù)、放療與化療,但患者預(yù)后較差。多形性膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)患者治療后的中位生存期不超過15個月。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標準,人類膠質(zhì)瘤可以分為I-IV級,其中III-IV級膠質(zhì)瘤的惡性程度高、侵襲性強。惡性膠質(zhì)瘤治療失敗的主要原因是局部腫瘤復(fù)發(fā),其中輻射耐受或輻射抵抗是放療后腫瘤復(fù)發(fā)的重要根源之一。以往資料表明,腫瘤輻射耐受的產(chǎn)生原因與腫瘤干細胞的存在、腫瘤微環(huán)境和DNA損傷修復(fù)水平等因素密切相關(guān)。因此,深入研究闡明膠質(zhì)瘤干細胞的輻射生物效應(yīng)、及其關(guān)鍵的分子機制問題十分重要,也是探索建立靶向腫瘤干細胞的腫瘤臨床放射治療新策略的重要途徑。研究表明,Wnt信號是干細胞增殖和分化的重要調(diào)控因子,Wnt/β-catenin信號通路在膠質(zhì)瘤中高度活躍,提示其與人類膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。以往的研究資料多集中于高劑量電離輻射對于膠質(zhì)瘤細胞的殺滅作用,尚缺乏針對膠質(zhì)瘤細胞與腫瘤干細胞的低劑量輻射生物效應(yīng)的研究。結(jié)合以往文獻和課題組針對神經(jīng)干細胞低劑量輻射刺激作用的線索,我們推測(Hypothesis)低劑量輻射可能通過誘導(dǎo)Wnt信號激活,刺激膠質(zhì)瘤細胞或干細胞樣細胞的增殖、促進腫瘤生長,具有重要的研究價值。因此,本研究應(yīng)用u251人膠質(zhì)瘤細胞,采用細胞分散培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)技術(shù),建立低劑量輻射的細胞模型和種植瘤動物模型,給予wnt信號通路選擇性抑制劑干預(yù)處理方法,著重研究闡明低劑量輻射對膠質(zhì)瘤細胞(或腫瘤干細胞樣細胞)的增殖活力和腫瘤生長作用、及其wnt/β-catenin信號通路激活的參與機制問題。研究方法1.體外細胞培養(yǎng)方法采用含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基,分別進行u251人膠質(zhì)瘤細胞系的分散培養(yǎng)和干細胞樣克隆培養(yǎng)。2.體內(nèi)種植瘤方法將u251細胞或干細胞樣細胞種植于裸鼠皮下,觀察腫瘤的形成、生長及腫瘤增殖等相關(guān)指標變化。3.低劑量輻射細胞模型采用低劑量(0.3gy、0.6gy)x-線電離輻射處理膠質(zhì)瘤細胞,觀察對腫瘤細胞增殖和生長的影響。4.wnt信號抑制劑干預(yù)采用wnt信號通路抑制劑iwr-1給藥處理,分析wnt信號激活參與膠質(zhì)瘤細胞或干細胞樣細胞增殖過程的作用。5.細胞活力檢測采用mtt方法和克隆形成實驗,比較分析不同處理條件下膠質(zhì)瘤細胞或干細胞樣細胞的細胞活力和細胞增殖。6.免疫細胞化學(xué)方法采用組織和細胞的免疫熒光染色方法,觀察膠質(zhì)瘤細胞的增殖、分化和wnt信號通路的相關(guān)分子在膠質(zhì)瘤細胞中的定位情況。7.westernblot方法采用蛋白印跡定量方法,觀察分析培養(yǎng)細胞和腫瘤組織的wnt信號通路等相關(guān)蛋白分子的表達水平與變化情況。研究結(jié)果1.u251人膠質(zhì)瘤細胞增殖、克隆生長和wnt/β-catenin信號通路分子的定位建立u251細胞分散培養(yǎng)、干細胞樣克隆培養(yǎng)體系,采用免疫熒光染色觀察cd133(腫瘤干細胞標志物)、gfap(星形膠質(zhì)細胞分化標志物)、ki-67(細胞增殖標志物)、nestin(神經(jīng)干細胞標志物)、brdu(細胞核增殖摻入標記物)、wnt信號通路相關(guān)蛋白分子的細胞定位。結(jié)果表明:多數(shù)u251細胞呈梭形或橢圓形、增殖和生長活躍,具備cd133強陽性和gfap弱陽性染色;無血清培養(yǎng)5-7天可獲得干細胞樣克隆球,克隆球細胞呈現(xiàn)ki-67和nestin強陽性染色;膠質(zhì)瘤細胞具有wnt1、wnt3a、wnt5a、β-catenin的陽性定位。該結(jié)果證明u251膠質(zhì)瘤細胞能夠表達腫瘤干細胞分子標記,增殖活躍,具有豐富wnt信號通路相關(guān)蛋白的表達定位特點。2.低劑量輻射刺激膠質(zhì)瘤細胞增殖、克隆生長作用及其wnt信號通路干預(yù)效應(yīng)采用mtt、克隆形成、劃痕遷移實驗、以及ki-67和pcna等細胞增殖指標的檢測,觀察分析膠質(zhì)瘤細胞活力和增殖。結(jié)果表明:與對照組相比,低劑量輻射能夠顯著刺激膠質(zhì)瘤細胞活力與增殖、促進克隆球形成、增加ki-67及pcna表達水平。給予wnt信號抑制劑iwr-1處理抑制低劑量輻射膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和克隆形成的刺激效應(yīng)。該結(jié)果說明,低劑量輻射能夠刺激膠質(zhì)瘤細胞(或腫瘤干細胞樣細胞)增殖和遷移,wnt信號激活介導(dǎo)了低劑量輻射的細胞生物刺激效應(yīng)。3.低劑量輻射對體內(nèi)種植膠質(zhì)瘤生長的刺激作用與wnt信號通路干預(yù)效應(yīng)通過裸鼠皮下注射u251細胞或膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞建立種植瘤模型,在細胞注射后第4、7、10、13、16、19、22天,觀察種植瘤的形成、生長、形態(tài)和ki-67免疫染色。結(jié)果表明:細胞注射后第13-22天能夠形成明顯的種植瘤;與對照組相比,低劑量輻射能夠促進種植瘤的大小、體積、重量和增加ki-67陽性細胞數(shù)目;而wnt信號抑制劑iwr-1處理能夠阻止低劑量輻射的刺激效應(yīng)。該結(jié)果說明低劑量輻射能夠刺激種植腫瘤的形成和生長,而wnt信號途徑的異常激活參與這一生物效應(yīng)過程。4.低劑量輻射刺激膠質(zhì)瘤細胞增殖和腫瘤生長作用的相關(guān)細胞內(nèi)信號通路分析采用24h/48h細胞培養(yǎng)樣本和第22天移植瘤組織樣本,westernblot檢測wnt、akt、erk1/2和jnk信號分子表達和磷酸化水平,分析其功能活化狀態(tài)。結(jié)果表明:與對照組相比,低劑量輻射引起wnt1、wnt2、wnt3a、wnt5a、β-catenin表達上調(diào),p-β-catenin表達下調(diào)。同時,低劑量輻射組的akt、p-akt、erk1/2、p-erk1/2表達上調(diào),jnk與p-jnk表達下調(diào)。給予wnt信號抑制劑iwr-1處理能夠減輕或逆轉(zhuǎn)上述蛋白分子表達的變化。該結(jié)果進一步證實了低劑量輻射刺激膠質(zhì)瘤細胞增殖和腫瘤生長過程中,wnt信號異常激活與可能下游機制,提示akt和erk1/2信號途徑激活可能共同參與膠質(zhì)瘤低劑量輻射生物效應(yīng)過程。但是,wnt信號通路與akt、erk1/2信號激活之間的確切關(guān)系與病理學(xué)意義,有待深入研究闡明。研究結(jié)論通過體外和體內(nèi)實驗研究,發(fā)現(xiàn)低劑量電離輻射能夠產(chǎn)生刺激人膠質(zhì)瘤細胞(或腫瘤干細胞樣細胞)的增殖和腫瘤形成,而且Wnt/β-catenin信號通路的異常激活參與低劑量輻射刺激膠質(zhì)瘤細胞(或腫瘤干細胞樣細胞)和腫瘤生長的生物效應(yīng)過程。該研究結(jié)果有助于我們深入認識膠質(zhì)瘤的病理發(fā)生機理,為進一步探索靶向膠質(zhì)瘤干細胞的放射治療策略提供了新的實驗證據(jù),具有理論和應(yīng)用意義。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 U251細胞 腫瘤干細胞 低劑量輻射 Wnt/β-catenin信號通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-16
• 文獻回顧16-31
• 第一部分 U251人膠質(zhì)瘤細胞增殖、克隆生長和Wnt/β-catenin信號通路分子定位31-39
• 1 實驗材料31-33
• 2 實驗方法33-35
• 3 實驗結(jié)果35-36
• 4 討論36-39
• 第二部分 低劑量輻射刺激膠質(zhì)瘤細胞增殖和克隆生長作用及其Wnt信號通路干預(yù)效應(yīng)39-46
• 1 實驗材料39-40
• 2 實驗方法40-43
• 3 實驗結(jié)果43-44
• 4 討論44-46
• 第三部分 低劑量輻射對體內(nèi)種植膠質(zhì)瘤生長的刺激作用與Wnt信號通路干預(yù)效應(yīng)46-51
• 1 實驗材料46-47
• 2 實驗方法47-49
• 3 實驗結(jié)果49
• 4 討論49-51
• 第四部分 低劑量輻射刺激膠質(zhì)瘤細胞增殖和腫瘤生長的相關(guān)細胞內(nèi)信號通路分析51-59
• 1 實驗材料51-54
• 2 實驗方法54-56
• 3 實驗結(jié)果56-57
• 4 討論57-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻60-78
• 附錄78-97
• 個人簡歷和研究成果97-98
• 致謝98

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本文編號：854130