本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)粘附分子NB3對缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：高原腦水腫是由急性缺氧引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能嚴(yán)重障礙,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重頭痛、嘔吐、共濟失調(diào),甚至昏迷、死亡,且致死率可高達(dá)40%,目前關(guān)于高原腦水腫的發(fā)病機制仍不清楚。在高原極端環(huán)境下,缺氧作為重要的致病因素,破壞血腦屏障完整性,促使血管源性腦水腫發(fā)生,是高原腦水腫發(fā)生的主要原因。血腦屏障是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu),其中腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的緊密連接是維持血腦屏障功能的關(guān)鍵。因此,探討缺氧對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間緊密連接的影響對于高原腦水腫發(fā)病機制的研究具有重要的意義。神經(jīng)粘附分子NB3,也稱contactin 6,是F3/contactin家族神經(jīng)識別分子成員之一,在神經(jīng)發(fā)育方面有重要作用。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn):NB3敲除小鼠急性缺氧后存活率明顯降低,加速了小鼠在高原缺氧下的死亡,且對伊文思藍(lán)的通透性顯著高于野生小鼠,推測NB3可能對血腦屏障具有一定的調(diào)節(jié)作用。基于實驗室的前期工作,本研究的主要科學(xué)問題是神經(jīng)粘附分子NB3是否參與缺氧下血腦屏障通透性的調(diào)節(jié),其作用機制如何?本研究利用NB3基因敲除小鼠探討其對缺氧下血管內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用。主要內(nèi)容包括(1)明確NB3在神經(jīng)系統(tǒng)不同類型細(xì)胞中的表達(dá)和定位。(2)體外培養(yǎng)的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,研究缺氧對中NB3表達(dá)和細(xì)胞緊密連接和通透性的影響。(3)NB3缺失或補充NB3對缺氧下小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性的影響。最后探討神經(jīng)粘附分子NB3在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中可能的作用方式。具體研究結(jié)果如下:1.神經(jīng)粘附分子nb3在神經(jīng)-血管單元中的表達(dá)和定位:血腦屏障由多種細(xì)胞構(gòu)成,包括腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞。首先,我們利用westernblot和免疫熒光的方法觀察了nb3在神經(jīng)-血管單元不同類型細(xì)胞中的表達(dá)定位,結(jié)果顯示nb3在神經(jīng)元和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞有明顯表達(dá),但在星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá),提示nb3在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有一定作用。2.缺氧對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞nb3表達(dá)及對細(xì)胞緊密連接和通透性的影響:westernblot和實時定量pcr結(jié)果顯示,隨著缺氧時間的延長,nb3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)明顯下降;同時細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白zo-1,occludin,claudin5,ve-cadheren表達(dá)降低�？鐑�(nèi)皮細(xì)胞電阻值(transendothelialelectricalresistant,teer)的測定結(jié)果顯示,隨著缺氧時間的延長,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞teer值逐漸降低,通透性增加。提示nb3可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的緊密連接影響內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。3.nb3缺失對缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性的影響:我們進一步原代分離培養(yǎng)nb3缺失的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,檢測nb3缺失的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧下teer值和熒光素鈉通透性。結(jié)果顯示nb3的缺失加重缺氧導(dǎo)致的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。westernblot和免疫熒光結(jié)果顯示,nb3的缺失加重缺氧導(dǎo)致的緊密連接蛋白claudin5和zo-1表達(dá)降低,進一步證明nb3可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接影響內(nèi)皮細(xì)胞通透性。4.補充nb3蛋白對缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性的影響:包被或添加可溶性nb3蛋白后檢測缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,結(jié)果顯示補充nb3蛋白可降低缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,免疫熒光顯示nb3促進缺氧下緊密連接蛋白的表達(dá),證明nb3在缺氧下對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護作用,同時提示nb3可能通過同親嗜性相互作用而發(fā)揮其該保護作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)粘附分子nb3在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),nb3缺失加重缺氧對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞,血管通透性增加,加重了腦損傷,而補充nb3蛋白可有效降低缺氧對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。證明nb3是缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞重要的內(nèi)源性保護分子,為研究高原腦水腫的發(fā)病機制提供新線索,為預(yù)防和治療高原缺氧腦損傷提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：NB3 contactin 6 缺氧 腦血管內(nèi)皮細(xì)胞 通透性 緊密連接
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-16
• 材料與方法16
• 1. 實驗材料16-21
• 1.1. 原代細(xì)胞和細(xì)胞株16
• 1.2. 實驗動物16
• 1.3. 實驗儀器設(shè)備16-17
• 1.4. 主要試劑及配方17-21
• 1.4.1. 抗體17-18
• 1.4.2. 常用試劑18-19
• 1.4.3. 主要試劑配制19-21
• 2. 實驗方法21-31
• 2.1. 小鼠DNA提取及基因型鑒定21-23
• 2.2. 原代腦血管內(nèi)皮細(xì)胞提取23-24
• 2.3. 細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.3.1. BMEC細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.3.2. 原代腦血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.4. 細(xì)胞的缺氧處理24
• 2.5. 細(xì)胞計數(shù)24-25
• 2.6. 檢測跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER)25
• 2.7. 檢測熒光素鈉(Na F)通透性25-26
• 2.8. 細(xì)胞免疫熒光26
• 2.9. Western Blot檢測蛋白表達(dá)26-28
• 2.9.1. 細(xì)胞總蛋白的提取26
• 2.9.2. 腦組織總蛋白的提取26
• 2.9.3. SDS-PAGE電泳26-28
• 2.10. 實時定量PCR檢測m RNA表達(dá)28-30
• 2.10.1. RNA的提取28
• 2.10.2. RNA質(zhì)量的檢測28
• 2.10.3. RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA28-29
• 2.10.4. 實時定量PCR29-30
• 2.11. 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析30-31
• 實驗結(jié)果31-51
• 一、神經(jīng)粘附分子NB3在神經(jīng)-血管單元中的表達(dá)31-32
• 二、小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定32-35
• 2.1. 原代小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)32-33
• 2.2. 原代小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定33-34
• 2.3. 永生化的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞BMEC的鑒定34-35
• 三、缺氧對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和緊密連接的影響35-40
• 3.1. 缺氧增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性36-37
• 3.2. 缺氧降低腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白及NB3的表達(dá)37-40
• 四、補充NB3蛋白對缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性的影響40-44
• 4.1. 可溶性NB3蛋白保護缺氧后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性40-41
• 4.2. 可溶性NB3蛋白促進降低缺氧后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的表達(dá)41-42
• 4.3. NB3的親同性作用對缺氧損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響42-44
• 五、NB3缺失對缺氧下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性的影響44-51
• 5.1. NB3基因敲除小鼠鑒定44-45
• 5.2. NB3缺失加重缺氧導(dǎo)致的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加45-46
• 5.3. NB3缺失加重缺氧對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的破壞46-51
• 5.3.1 NB3缺失加重缺氧導(dǎo)致的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)下降46-48
• 5.3.2 B3缺失加重缺氧導(dǎo)致的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形態(tài)學(xué)變化48-51
• 討論51-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻54-61
• 文獻綜述61-74
• 參考文獻67-74
• 縮略詞表74-76
• 攻讀學(xué)位期間文章情況76-77
• 致謝77-78
• 個人簡歷78

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