發(fā)布時(shí)間：2017-09-03 07:32

  本文關(guān)鍵詞：ACEA促進(jìn)線粒體生物發(fā)生減輕腦缺血損傷的機(jī)制研究

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【摘要】：眾所周知,腦卒中是導(dǎo)致患者神經(jīng)功能障礙的重要原因之一,其發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率呈逐年升高趨勢。盡管溶栓療法是治療阻塞性腦卒中的一種有效治療方式,但由于治療時(shí)間窗狹窄,以及rt-PA等溶栓藥物存在各種副作用,目前僅有3-5%患者能夠接受治療并可能從中受益。因此,腦卒中仍是威脅人類生命和生活質(zhì)量的重大疾患。腦缺血再灌注后線粒體參與了內(nèi)環(huán)境中一系列復(fù)雜的變化,包括鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),活性氧自由基的產(chǎn)生,細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路的活化等。研究證實(shí),線粒體不斷地進(jìn)行著生物發(fā)生、自噬、融合與分裂等動(dòng)態(tài)變化,這對(duì)保證線粒體的新老交替和維持線粒體的正常功能起到重要作用。其中線粒體生物發(fā)生不僅增加了細(xì)胞中線粒體的數(shù)量和質(zhì)量,滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求,還可以促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)元的恢復(fù),改善神經(jīng)元功能。已有大量研究證實(shí),腦缺血狀態(tài)下,線粒體生物發(fā)生是一個(gè)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)反應(yīng),誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生是一個(gè)新的神經(jīng)保護(hù)策略。同時(shí),有研究表明抑制糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)能夠促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生,減少缺血引起的腦損傷,而激活大麻素受體1(CB1R)可以促進(jìn)GSK-3β第9位絲氨酸的磷酸化,即使其失活。然而,內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在腦缺血-再灌注后對(duì)線粒體生物發(fā)生的影響如何,目前尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探索cb1r特異性激動(dòng)劑acea(arachidonyl-2-chloroethyl-amide)是否通過gsk-3β誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。為此,我們展開以下研究。研究一:cb1r特異性激動(dòng)劑acea減輕腦缺血損傷【目的】研究acea對(duì)大鼠腦缺血損傷的治療作用及其最佳有效劑量�！痉椒ā砍赡晷坌詓d大鼠70只,隨機(jī)分為5組,在腦缺血再灌注后1h腹腔注射生理鹽水(vehicle組)或不同濃度的acea(0,0.5,1,2mg/kg),通過ttc染色(n=8)、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(n=6)對(duì)大鼠腦功能進(jìn)行評(píng)估。另取成年雄性sd大鼠20只,隨機(jī)分為四組:sham,mcao,acea和vehicle組,使用tunel染色(n=5)的方法,觀察acea是否減少凋亡神經(jīng)元的數(shù)量�！窘Y(jié)果】與vehicle組相比,1mg/kg和2mg/kg的acea能夠明顯減少大鼠腦梗死體積(p0.05),并且提高了大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(p0.05)。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取1mg/kg這個(gè)最低有效劑量作為治療劑量。tunel染色結(jié)果顯示給予acea后明顯減少神經(jīng)元凋亡數(shù)量(p0.05),單純給予vehicle則沒有這種作用�！窘Y(jié)論】acea具有治療腦缺血損傷的作用,且其最佳有效劑量為1mg/kg。研究二:acea促進(jìn)線粒體生物發(fā)生并改善線粒體功能減輕腦缺血損傷【目的】觀察acea對(duì)腦缺血損傷后線粒體生物發(fā)生相關(guān)分子、線粒體數(shù)量和體積以及線粒體功能的影響�！痉椒ā�1.為研究acea對(duì)線粒體生物發(fā)生相關(guān)分子的影響,將雄性sd大鼠56只,隨機(jī)分為sham組和mcao組,其中mcao組再隨機(jī)分為6組,即mcao2h、acea2h、mcao4h、acea4h、mcao24h、acea24h,在缺血再灌注后2h,4h,24h取缺血半暗帶腦組織,westernblot檢測nrf-1,tfam和coxiv等線粒體生物發(fā)生相關(guān)分子(n=4)。在缺血再灌注后4h取腦組織進(jìn)行免疫熒光染色,檢測nrf-1,tfam和coxiv等線粒體生物發(fā)生相關(guān)分子(n=4)。2.為研究acea對(duì)線粒體數(shù)量和體積的影響,將雄性sd大鼠9只,隨機(jī)分為假手術(shù)sham組和mcao組,其中mcao組再隨機(jī)分為2組,即給予acea和不給acea(mcao組),在缺血再灌注后4h取腦組織,通過透射電鏡觀察線粒體數(shù)量和體積的變化。3.為研究acea對(duì)線粒體功能的影響,培養(yǎng)原代神經(jīng)元,建立ogd模型模擬腦缺血損傷,通過ldh釋放試驗(yàn)和cck-8檢測細(xì)胞活力篩選出acea治療損傷神經(jīng)元的最佳有效劑量,然后根據(jù)此劑量檢測線粒體的各項(xiàng)功能。我們將細(xì)胞分為4組:control組、ogd組、acea組和vehicle組,acea組為復(fù)氧復(fù)糖即刻給予acea,vehicle組為復(fù)氧復(fù)糖即刻給予溶劑。通過檢測三磷酸腺苷(atp),線粒體膜通透轉(zhuǎn)化孔(mptp),線粒體膜電位(mmp),丙二醛(mda)和活性氧(ros)的含量,對(duì)線粒體的功能進(jìn)行評(píng)估,最后通過流式細(xì)胞檢測神經(jīng)元存活情況�！窘Y(jié)果】1.westernblot結(jié)果顯示mcao后2h和4h,acea可上調(diào)nrf-1的表達(dá)(p0.05);在給予acea后2h,4h和24h,上調(diào)tfam和coxiv表達(dá)(p0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示給予acea后4h,nrf-1,tfam和coxiv的表達(dá)都明顯上調(diào)(p0.05)。2.透射電鏡結(jié)果顯示給予acea可以顯著增加線粒體的數(shù)量(p0.05),增大線粒體體積(p0.05),說明acea促進(jìn)新線粒體的生成。3.與vehicle組相比,acea能夠促進(jìn)atp的生成(p0.05),提高線粒體膜電位(p0.05),減少線粒體膜通道轉(zhuǎn)化孔的開放(p0.05),減少ros(p0.05)和mda的生成(p0.05),從而改善了線粒體的功能。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示acea明顯減少ogd引起的神經(jīng)元凋亡數(shù)量(p0.05)�！窘Y(jié)論】acea能夠促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生,改善線粒體的功能,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究三:gsk-3β參與acea促進(jìn)線粒體生物發(fā)生并改善線粒體功能的作用【目的】研究gsk-3β不同磷酸化水平對(duì)acea促進(jìn)線粒體生物發(fā)生和改善線粒體的功能的影響�！痉椒ā�1.為檢測腦缺血后gsk-3β及其磷酸化水平的變化,將雄性sd大鼠20只,隨機(jī)分為sham組和mcao組,其中mcao組再隨機(jī)分為4組:即mcao2h、acea2h、mcao4h和acea4h,在腦缺血再灌后2h,4h取缺血半暗帶腦組織(n=4),westernblot檢測gsk-3β及其磷酸化水平變化。2.研究抑制gsk-3β磷酸化對(duì)線粒體生物發(fā)生的影響,將雄性sd大鼠28只,隨機(jī)分為sham組和mcao組,其中mcao組再隨機(jī)分為6組,即mcao、acea、acea+wrt、acea+vehicle(w)、acea+ly和acea+vehicle(l),wrt和ly為pi3k的兩個(gè)抑制劑,它們可以阻斷gsk-3β的磷酸化。在腦缺血再灌注后4h取缺血半暗帶腦組織,通過westernblot檢測線粒體生物發(fā)生的標(biāo)記分子物nrf-1,tfam和coxiv的表達(dá)情況。3.研究促進(jìn)gsk-3β磷酸化對(duì)線粒體生物發(fā)生的影響,將雄性sd大鼠20只,隨機(jī)分為sham組和mcao組,其中mcao組再隨機(jī)分為4組:即mcao、acea、acea+vehicle(t)和tdzd-8,tdzd-8為gsk-3β抑制劑,它可以模擬gsk-3β處于其磷酸化狀態(tài)。在腦缺血再灌注后4h取缺血半暗帶腦組織,通過westernblot檢測線粒體生物發(fā)生的標(biāo)記分子物nrf-1,tfam和coxiv的表達(dá)情況,觀察促進(jìn)gsk-3β磷酸化能否影響線粒體生物發(fā)生。4.為研究gsk-3β磷酸化對(duì)線粒體功能的影響,培養(yǎng)原代神經(jīng)元,建立ogd模型模擬腦缺血損傷,在給予acea的基礎(chǔ)上使用pi3k抑制劑wrt和ly或gsk-3β抑制劑tdzd-8,檢測atp,mptp,mmp,mda和ros的含量,對(duì)線粒體的功能進(jìn)行評(píng)估�！窘Y(jié)果】1.大鼠在腦缺再灌注后2h和4h,gsk-3β的表達(dá)含量無明顯變化,但gsk-3β的磷酸化水平顯著增高(p0.05)。2.westernblot結(jié)果顯示,與vehicle相比,抑制gsk-3β向其磷酸化轉(zhuǎn)變,線粒體生物發(fā)生相關(guān)分子nrf-1,tfam和coxiv的表達(dá)下降(p0.05)。3.westernblot結(jié)果顯示,與vehicle相比,促進(jìn)gsk-3β向其磷酸化轉(zhuǎn)變,線粒體生物發(fā)生相關(guān)分子Nrf-1,Tfam和COX IV的表達(dá)升高(P0.05)。4.在原代神經(jīng)元上進(jìn)一步證實(shí),促進(jìn)GSK-3β向其磷酸化轉(zhuǎn)變,能夠促進(jìn)ATP的生成(P0.05),提高線粒體膜電位(P0.05),減少線粒體膜通道轉(zhuǎn)化孔的開放(P0.05),減少ROS(P0.05)和MDA(P0.05)的生成,從而改善了線粒體的功能。反之,抑制GSK-3β磷酸化降低線粒體功能�！窘Y(jié)論】ACEA通過調(diào)節(jié)GSK-3β磷酸化促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生并改善線粒體功能,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。ACEA激活CB1R是促進(jìn)線粒體生物發(fā)生的始動(dòng)因素,調(diào)節(jié)GSK-3β磷酸化是ACEA控制線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),為腦卒中治療提供新的藥物靶點(diǎn),也將為腦卒中治療提供新途徑。
【關(guān)鍵詞】：ACEA 大麻素1型受體 腦缺血損傷 線粒體生物發(fā)生 糖原合酶激酶-3β
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-31
• 實(shí)驗(yàn)一 CB1R特異性激動(dòng)劑ACEA減輕腦缺血損傷31-38
• 1 材料31-32
• 2 方法32-35
• 3 結(jié)果35-37
• 4 討論37-38
• 實(shí)驗(yàn)二 ACEA促進(jìn)線粒體生物發(fā)生減輕腦缺血損傷38-53
• 1 材料38-41
• 2 方法41-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-53
• 實(shí)驗(yàn)三 GSK-3Β參與ACEA促進(jìn)線粒體生物發(fā)生與改善線粒體功能53-61
• 1 材料53
• 2 方法53-56
• 3 結(jié)果56-59
• 4 討論59-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 附錄70-72
• 個(gè)人簡歷和研究成果72-73
• 致謝73

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本文編號(hào)：783703