發(fā)布時間：2017-09-02 23:36

  本文關(guān)鍵詞：SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

  更多相關(guān)文章： 腦動脈血管 內(nèi)皮細胞 細胞培養(yǎng)

【摘要】：背景血管新生是從即有血管的內(nèi)皮細胞增殖或游走到其他地方從新形成子代血管分支的過程。腦動脈新生可以重建有效血供,從而改善多發(fā)性、彌漫性腦動脈粥樣硬化(Cerebral atherosclerosis,CAS)所致的腦缺血,最終預(yù)防癡呆和腦梗死發(fā)生。近年來許多的與血管新生有關(guān)的基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制在胚胎腦血管發(fā)生的研究成果,為腦血管新生的研究已經(jīng)奠定下了理論基礎(chǔ)[1]。Yoshimura S將帶有肝細胞生長因子的HVJ(野生型病毒) liposome的復(fù)合基因載體注射到大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔,可以見到大腦腦表面的新生血管增多,大腦的灌注量也增加明顯,從而顯示了肝細胞生長因子促進大腦血管生成的作用[2]。近幾年來關(guān)于動脈新生機制的研究成果不斷取得進展[3,4,5,6]。在中文、外文數(shù)據(jù)庫均沒有找到SD大鼠CAEC的體外培養(yǎng)方法,給相關(guān)實驗研究帶來一定的困難。雖然SD大鼠腦微血管的內(nèi)皮細胞(BMECs)的培養(yǎng)方法成熟,但腦動脈內(nèi)皮細胞(Cerebral Artery Endothelial Cell,CAEC)不同于大腦微血管的內(nèi)皮細胞(BMECs),腦動脈內(nèi)皮細胞不參與構(gòu)成血腦屏障,兩種細胞表現(xiàn)不同的功能異質(zhì)性[7]。SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)為體外研究腦動脈新生機制研究提供基礎(chǔ)。DF大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)難度較大,我們經(jīng)過過對國內(nèi)、外細胞培養(yǎng)方法進行分析和反復(fù)試驗,總結(jié)出了能夠培養(yǎng)純化度較高的SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法。目的探討獲取純度較高的體外原代SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞(Cerebral Artery Endothelial Cell,CAEC)的培養(yǎng)方法并鑒定,并測定SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的增值和遷移能力。方法選取5~6周SD雄性大鼠6只,體重110-140g,無菌條件下取鼠腦、腦動脈,采用剪碎、組織塊原代培養(yǎng)大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的方法,接種于明膠包被的直徑35mm培養(yǎng)皿中,應(yīng)用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng);經(jīng)過消化傳代,用第3代細胞,在倒置相差顯微鏡下進行細胞形態(tài)的觀察,在普通光學(xué)顯微鏡下對細胞第Ⅷ因子免疫細胞化學(xué)染色進行觀察,在熒光顯微鏡下對細胞第Ⅷ因子免疫熒光染色進行觀察,從這三個方面對細胞進行鑒定。應(yīng)用MTT檢測法測定SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的增殖能力,應(yīng)用細胞劃痕實驗檢測大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞的遷移能力。結(jié)果培養(yǎng)60h后可見細胞從貼壁的血管片段周圍長出,細胞呈梭形;培養(yǎng)7d細胞可融合成片;融合后的腦動脈細胞呈典型的“鵝卵石”樣外觀;免疫熒光法檢測顯示動脈內(nèi)皮標志物Ⅷ因子相關(guān)抗原表達陽性,內(nèi)皮細胞純度90%以上。1.培養(yǎng)60h后于倒置相差顯微鏡下觀察,可見細胞從貼壁的血管片段周圍長出(圖1-C),細胞呈梭形;培養(yǎng)7d細胞可融合成片(圖1-E);融合后的腦動脈內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)出內(nèi)皮細胞典型的“鋪路石”樣外觀;細胞之間的大小和形狀都較為均勻一致,原代培養(yǎng)9d細胞的融合度達到80%以上(圖1-F)。1:3傳代后24 h可見培養(yǎng)皿散在梭型細胞貼壁,傳代后6 d長滿可繼續(xù)傳代,傳6代細胞增值能力及形態(tài)無改變。2.免疫細胞化學(xué)染色和免疫熒光鑒定:細胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性,胞漿著色呈棕褐色,PBS代替一抗加入設(shè)置陰性對照,染色呈陰性(圖4);細胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色,胞漿呈現(xiàn)綠色,胞核被染為藍色,PBS代替一抗加入設(shè)置陰性對照,染色呈陰性(圖2)。內(nèi)皮細胞純度90%以上。3.MTT法檢測細胞增殖情況,第4-8天生長速度較快,9-12天生長速度明顯減慢(見圖5)。劃痕實驗,培養(yǎng)48h后,細胞受損邊緣帶見少數(shù)散在的遷移出來的腦動脈內(nèi)皮細胞(見圖6)。結(jié)論選取5~6周SD雄性大鼠6只,體重110-140g,采用組織塊培養(yǎng)法,應(yīng)用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)可以成功獲得純度90%的大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞。
【關(guān)鍵詞】：腦動脈血管 內(nèi)皮細胞 細胞培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 1 材料與方法12-21
• 2 結(jié)果21-23
• 3 討論23-29
• 4 實驗經(jīng)過及經(jīng)驗總結(jié)29-30
• 5 結(jié)論30
• 6 本課題研究意義及前期研究內(nèi)容30-33
• 附圖33-36
• 參考文獻36-39
• 綜述 HGF用于治療腦缺血性疾病的研究進展39-48
• 參考文獻44-48
• 附錄 中英文對照詞表48-49
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況49-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊光田,宋振舉,陸德琴,王迪潯;左旋四氫巴馬汀在腦動脈內(nèi)皮細胞缺氧復(fù)氧時對一氧化氮合酶ⅢmRNA表達的影響[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2003年07期

2 ;[J];;年期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張守瑞;SD大鼠腦動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2016年

，

本文編號：781594