本文關(guān)鍵詞：腫瘤壞死因子通過(guò)自噬溶酶體途徑影響α-突觸核蛋白的清除

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【摘要】：目的:研究腫瘤壞死因子(TNF)對(duì)α-突觸核蛋白(α-synuclein)降解清除的影響,探討自噬溶酶體通路在其中的作用和機(jī)制。方法:以高分化PC12細(xì)胞為工具細(xì)胞,以重組TNF或活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNF作用于PC12細(xì)胞作為模型。以細(xì)菌脂多糖(LPS)作用于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞并收集培養(yǎng)上清作為小膠質(zhì)細(xì)胞條件性培養(yǎng)基,以ELISA檢測(cè)條件培養(yǎng)基內(nèi)TNF及IL-1β的含量;使用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率;采用Western blot方法檢測(cè)α-synuclein蛋白、自噬標(biāo)記蛋白LC3II、p62及溶酶體表面標(biāo)志物L(fēng)AMP1等蛋白的表達(dá)變化;利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法的方法構(gòu)建PC12細(xì)胞內(nèi)LC3過(guò)表達(dá)模型;運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)α-synuclein和p62的m RNA水平;聯(lián)合免疫熒光和共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3和溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1共定位;以Lyso Tracker檢測(cè)溶酶體酸性強(qiáng)度;使用Lyso Sensor Yellow/Blue dextran探針定量測(cè)定溶酶體內(nèi)的p H。結(jié)果:LPS作用后的小膠質(zhì)細(xì)胞條件性培養(yǎng)基中IL-1β含量約為(320±67.8)pg/ml,TNF含量約為(1400±93.2)pg/ml,均顯著高于對(duì)照組(P0.01)。以anti-TNF抗體與條件性培養(yǎng)基共孵育后,條件培養(yǎng)上清中TNF含量明顯減少,而IL-1β含量無(wú)顯著變化。將anti-TNF抗體結(jié)合或未結(jié)合的LPS刺激的條件性培養(yǎng)基或陰性對(duì)照組條件性培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移作用于PC12細(xì)胞,LPS刺激的條件性培養(yǎng)基組(anti-TNF未結(jié)合)α-synuclein水平明顯高于正常PC12對(duì)照組和陰性對(duì)照條件培養(yǎng)基作用組,TNF去除組(與anti-TNF抗體結(jié)合)α-synuclein蛋白水平明顯低于anti-TNF未結(jié)合組,。重組小鼠源性TNF-α(0、1、5、10、50、100和500 ng/ml)作用于PC12細(xì)胞,細(xì)胞存活率呈TNF-α濃度依賴性下降,α-synuclein的蛋白水平呈TNF-α濃度依賴性先上升后下降,而α-synuclein的m RNA水平無(wú)顯著變化;用蛋白酶體抑制劑MG132抑制UPS通路時(shí),α-synuclein的蛋白水平對(duì)比對(duì)照組并未發(fā)生明顯的改變,用自噬阻斷劑CQ抑制ALP通路時(shí),α-synuclein的蛋白水平較對(duì)照組明顯增加;LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平出現(xiàn)TNF-α濃度依賴性的同步增加,而p62的m RNA并未出現(xiàn)改變,過(guò)表達(dá)LC3后游離GFP蛋白水平隨TNF-α的作用下降;在TNF-α的作用下,PC12細(xì)胞內(nèi)的GFP-LC3(綠色熒光)和溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1(紅色熒光)可以完全共定位,Lyso Tracker熒光強(qiáng)度下降,溶酶體內(nèi)p H上升;m TORC1抑制劑PP242可以促進(jìn)溶酶體酸化,轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)和溶酶體表面標(biāo)志蛋白(LAMP1)表達(dá)水平上調(diào),溶酶體p H降低,部分逆轉(zhuǎn)TNF引起的α-synuclein蛋白的蓄積增加。結(jié)論:TNF是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞生成和分泌的主要促炎癥細(xì)胞因子之一;TNF導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體通路功能障礙、引起α-synuclein蛋白異常蓄積。PP242可完善自噬溶酶體通路從而促進(jìn)α-synuclein的降解。
【關(guān)鍵詞】：自噬 α-synuclein 溶酶體 TNF
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 研究背景9-13
• 參考文獻(xiàn)10-13
• 材料和方法13-24
• 結(jié)果24-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 綜述40-46
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 中英文對(duì)照縮略詞表46-47
• 攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文及科研成果47-48
• 致謝48-49

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本文編號(hào)：774413