本文關(guān)鍵詞：N2a細(xì)胞氧糖剝奪模型中Ⅲ型PI3K-Beclin 1自噬途徑的研究

  更多相關(guān)文章： 自噬 腦缺血 氧糖剝奪 Ⅲ型PI3K Beclin 1非依賴性自噬

【摘要】：我國(guó)作為人口大國(guó),早已步入了老齡化社會(huì)。年齡作為腦血管疾病的不可干預(yù)危險(xiǎn)因素,卒中患病率隨年齡逐漸上升,60歲~64歲達(dá)到患病高峰,隨后逐漸下降。2014年中國(guó)腦卒中大會(huì)的數(shù)據(jù)表明,近25年,我國(guó)腦卒中患病率以每年8.1%速度增加。腦梗死在我國(guó)卒中患者數(shù)量中位居首位,約占78%。缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜,尚未完全明確。因此,近年來(lái),探索缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)代謝機(jī)制。該機(jī)制負(fù)責(zé)降解和循環(huán)再利用受損及功能喪失的細(xì)胞成分和細(xì)胞器。自噬過(guò)程主要包括自噬體的形成以及自噬溶酶體的形成(后者是自噬體與溶酶體的融合)。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明自噬參與腦血管疾病之中。但至于自噬在腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用,目前并沒(méi)有統(tǒng)一的定論。腦缺血可以通過(guò)多種信號(hào)通路來(lái)激活自噬,本實(shí)驗(yàn)主要探討Ⅲ型PI3K-Beclin 1自噬途徑在缺血性腦血管疾病中的作用。本實(shí)驗(yàn)首先采用小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(mouse neuroblastoma N2a cells,N2a)經(jīng)過(guò)氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)處理來(lái)模擬腦缺血損傷。自噬相關(guān)蛋白包括微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、Beclin 1、P62又稱為死骨片1(Sequestosome 1,SQSTM1)和溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)等。應(yīng)用western blot方法檢測(cè)這些自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量,并測(cè)定經(jīng)過(guò)OGD處理后N2a細(xì)胞酸性磷酸酶活性及細(xì)胞活力。然后我們檢測(cè)了PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)對(duì)經(jīng)過(guò)OGD處理的N2a細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平,細(xì)胞活力及酸性磷酸酶活性的影響。最后我們應(yīng)用shRNA慢病毒技術(shù)干擾Beclin 1基因表達(dá)后再分析經(jīng)過(guò)OGD處理的N2a細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)、酸性磷酸酶活性以及細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示:1)在OGD處理后,N2a細(xì)胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1及p62/SQSTM1蛋白均表達(dá)增加,而LAMP2蛋白變化不明顯;OGD處理增加了酸性磷酸酶活性而減弱了細(xì)胞活力。2)N2a細(xì)胞給予3-MA(5mM)后,減少了經(jīng)過(guò)OGD處理后LC3Ⅱ以及LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá),增加了p62/SQSTM1的表達(dá),而對(duì)LAMP2和Beclin 1的蛋白表達(dá)影響不明顯;不管是對(duì)照組還是OGD組,使用3-MA后,N2a細(xì)胞酸性磷酸酶活性和細(xì)胞活力都明顯下降。3)無(wú)論在對(duì)照組,還是在OGD8 h和OGD12 h組,當(dāng)Beclin 1的表達(dá)被干擾后,N2a細(xì)胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62/SQSTM1和LAMP2蛋白表達(dá)均增加、酸性磷酸酶活性增加,而細(xì)胞活力變化不明顯。綜上所述,本研究通過(guò)以上一系列的實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了:1)OGD處理能誘導(dǎo)Beclin 1非依賴性自噬,且此種自噬是不通過(guò)Ⅲ型PI3K-Beclin 1信號(hào)途徑而進(jìn)行調(diào)控的;2)OGD處理增加的自噬活性對(duì)細(xì)胞是起保護(hù)性作用的;3)p62/SQSTM1的蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞自噬活性并不總是呈負(fù)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：自噬 腦缺血 氧糖剝奪 Ⅲ型PI3K Beclin 1非依賴性自噬
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-14
• 緒論14-20
• 第一部分 N2a細(xì)胞氧糖模型的建立20-36
• 引言20
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 1.1.1 細(xì)胞株20
• 1.1.2 主要試劑20-22
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備22
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法22-30
• 1.2.1 N2a細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 1.2.2 OGD細(xì)胞模型的建立23-24
• 1.2.3 CCK8檢測(cè)OGD后各組細(xì)胞活力24
• 1.2.4 Western blot檢測(cè)OGD后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)24-28
• 1.2.5 酸性磷酸酶活性的檢測(cè)28-29
• 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理29-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 1.3.1 OGD后N2a的細(xì)胞形態(tài)變化30
• 1.3.2 OGD處理減弱N2a細(xì)胞活力30-31
• 1.3.3 OGD增加N2a細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)31-33
• 1.3.4 OGD增加了N2a細(xì)胞酸性磷酸酶活性33-34
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論34-36
• 第二部分 OGD中3-MA對(duì)N2a細(xì)胞自噬及活性的影響36-46
• 引言36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料36-38
• 2.1.1 細(xì)胞株36
• 2.1.2 主要試劑36-38
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法38-41
• 2.2.1 N2a細(xì)胞培養(yǎng)38-39
• 2.2.2 3-MA儲(chǔ)存于的配制及用法39
• 2.2.3 Western blot檢測(cè) 3-MA處理后N2a細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)39-40
• 2.2.4 酸性磷酸酶活性的檢測(cè)40
• 2.2.5 CCK8檢測(cè)OGD后各組細(xì)胞活力40-41
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 2.3.1 3-MA對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響41-42
• 2.3.2 3-MA降低N2a細(xì)胞酸性磷酸酶活性42-43
• 2.3.3 3-MA降低N2a細(xì)胞活力43-44
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論44-46
• 第三部分 Beclin 1基因沉默對(duì)OGD中N2a細(xì)胞自噬及活性的影響46-73
• 引言46-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料47-49
• 3.1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞株47
• 3.1.2 主要試劑47-49
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備49
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法49-62
• 3.2.1 sh RNA序列設(shè)計(jì)49-51
• 3.2.2 構(gòu)建表達(dá)sh RNA的質(zhì)粒載體51-55
• 3.2.3 293FT細(xì)胞培養(yǎng)55-56
• 3.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞56
• 3.2.5 慢病毒感染N2a細(xì)胞56-57
• 3.2.6 q RT-PCR檢測(cè)Beclin 1 m RNA表達(dá)水平57-60
• 3.2.7 western檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平60
• 3.2.8 Beclin 1 干擾后對(duì)N2a細(xì)胞酸性磷酸酶活性的作用60-61
• 3.2.9 Beclin 1 干擾后對(duì)N2a細(xì)胞活力的影響61-62
• 3.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理62
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-69
• 3.3.1 sh RNA質(zhì)粒構(gòu)建成功62-63
• 3.3.2 慢病毒成功感染N2a細(xì)胞63-64
• 3.3.3 Beclin 1 sh RNA抑制N2a細(xì)胞中Beclin 1 m RNA表達(dá)64-65
• 3.3.4 Beclin 1 sh RNA抑制N2a細(xì)胞中Beclin 1 蛋白表達(dá)65-66
• 3.3.5 Beclin 1 干擾后對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響66-67
• 3.3.6 Beclin 1 干擾后增加了N2a細(xì)胞酸性磷酸酶活性67-68
• 3.3.7 Beclin 1 干擾后對(duì)N2a細(xì)胞自噬活性的影響68-69
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論69-73
• 全文結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 致謝78-79
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄79

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