本文關鍵詞：新烷化劑替莫唑胺酯抗腦膠質瘤的作用及機制研究

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【摘要】：目的:1.考察新烷化劑替莫唑胺酯(TMZ-HE)體外對惡性腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用。2.進一步考察TMZ-HE對TMZ耐藥細胞系的抑制作用3.初步探討TMZ-HE抑制腦膠質瘤細胞增殖和克服TMZ耐藥的作用機制。方法:1.為檢測TMZ-HE體外對惡性腦膠質瘤細胞的作用效果,選取三種MGMT表達水平不同的膠質瘤細胞系,采用MTT比色法檢測TMZ-HE對膠質瘤細胞T98G,LN229和LN-18的增殖抑制作用;利用克隆形成能力實驗檢測TMZ-HE對膠質瘤細胞LN-18克隆形成的影響;利用流式細胞儀檢測TMZ-HE誘導膠質瘤細胞凋亡的發(fā)生率;2.為進一步驗證TMZ-HE克服腦膠質瘤細胞系對TMZ耐藥的作用,首先通過慢病毒感染法構建高表達MGMT的LN229/MGMT耐藥細胞系,再通過藥物分期誘導建立不表達MGMT的耐藥細胞系SHG-44/TMZ;采用Western Blot法鑒定LN229/MGMT和SHG-44/TMZ兩種耐藥細胞系中MGMT的表達情況后,利用MTT比色法檢測TMZ-HE對耐藥細胞系LN229/MGMT和SHG-44/TMZ的增殖抑制作用;3.為初步探討TMZ-HE的作用機制,檢測TMZ-HE對耐藥蛋白MGMT的影響以及誘導細胞凋亡的作用機制;通過Western Blot檢測藥物處理后T98G細胞中耐藥蛋白MGMT表達、LN229,T98G細胞中DNA損傷指標γH2AX蛋白表達以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達;通過流式細胞儀檢測TMZ-HE對膠質瘤細胞周期的影響;結果:1.TMZ-HE對MGMT表達水平不同的膠質瘤細胞系都具有增殖抑制和誘導凋亡的作用,且體外作用效果優(yōu)于TMZ。1)Western blot實驗結果顯示,T98G細胞中耐藥蛋白MGMT表達量最高,其次為LN-18細胞,敏感細胞系LN229中不表達耐藥蛋白MGMT。2)MTT實驗結果顯示,TMZ-HE能夠抑制膠質瘤細胞系LN229,LN-18和T98G的增殖,且抑制作用優(yōu)于TMZ,說明,TMZ-HE對MGMT不同表達水平的膠質瘤細胞的增殖抑制作用均優(yōu)于TMZ。3)流式細胞儀檢測結果表明TMZ,TMZ-HE能夠誘導膠質瘤細胞發(fā)生凋亡,藥物作用96h其凋亡率隨藥物濃度增加不斷增加,200,400μmol/L的TMZ-HE誘導LN229,T98G細胞的凋亡率明顯高于TMZ,結果具有顯著的統(tǒng)計學差異。2.TMZ-HE一定程度上能夠克服TMZ耐藥,特別是MGMT高表達的耐藥細胞。1)膠質瘤耐藥細胞的建立:Western blot結果顯示LN229/MGMT細胞中高表達MGMT,SHG-44/TMZ細胞中不表達MGMT。2)TMZ-HE和TMZ對原發(fā)及獲得性耐藥細胞增殖抑制作用的比較:MTT實驗結果表明,①TMZ-HE對高表達MGMT的原發(fā)耐藥細胞系T98G和獲得性耐藥細胞系LN229/MGMT的增殖抑制作用優(yōu)于TMZ,對MGMT不表達的耐藥細胞系SHG-44/TMZ的增殖抑制作用同樣優(yōu)于TMZ(P0.05);②TMZ-HE和TMZ對不表達MGMT的耐藥細胞系SHG-44/TMZ增殖抑制作用不如表達MGMT的耐藥細胞系。TMZ-HE對耐藥細胞系的增殖抑制作用由大到小為LN229/MGMTT98GSHG-44/TMZ。3.針對實驗中測試的幾個可能作用機制,TMZ-HE與TMZ對其關鍵蛋白的調節(jié)趨勢相似,但TMZ-HE的調節(jié)作用明顯高于TMZ。1)增加DNA損傷指標γH2AX的表達量:TMZ、TMZ-HE作用LN229、T98G細胞后,均能導致DNA損傷指標γH2AX的表達量增加。2)調節(jié)細胞凋亡:TMZ和TMZ-HE均通過上調促凋亡蛋白Bax,下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達誘導細胞發(fā)生凋亡。3)細胞周期阻滯:TMZ和TMZ-HE能夠使膠質瘤細胞發(fā)生G2期阻滯,但400μmol/L的TMZ-HE還能導致細胞的S期發(fā)生阻滯。4)下調耐藥蛋白對MGMT表達量:Western blot法檢測TMZ、TMZ-HE處理T98G后MGMT蛋白的表達量,其結果表明,兩種藥物均能下調MGMT的表達量,但與TMZ相比,TMZ-HE對MGMT表達量的下調作用表現(xiàn)得更強也更快速。結論:1.TMZ-HE能夠抑制敏感和原發(fā)性耐藥膠質瘤細胞增殖,同時能夠誘導其發(fā)生凋亡,其增殖抑制和誘導凋亡的作用效果都優(yōu)于TMZ。2.TMZ-HE對耐藥蛋白MGMT的抑制活性明顯的高于TMZ。,在一定程度上克服了膠質瘤細胞對TMZ的原發(fā)和獲得性耐藥。3.TMZ-HE抑制膠質瘤細胞增殖的作用機制與TMZ相似,既可通過造成DNA損傷,又可通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2及上調促凋亡基因Bax誘導細胞凋亡。此外,兩者還具有G2期阻滯作用;但是TMZ-HE對耐藥蛋白MGMT的抑制活性明顯高于TMZ,這可能與TMZ-HE的作用效果優(yōu)于TMZ有關。
【關鍵詞】：替莫唑胺 替莫唑胺酯 細胞凋亡 Bax
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-19
• 研究現(xiàn)狀、成果13-17
• 研究目的、方法17-19
• 一、TMZ-HE對惡性腦膠質瘤體外的抑制作用19-43
• 1.1 對象和材料19-20
• 1.1.1 實驗對象19
• 1.1.2 實驗材料19
• 1.1.3 實驗儀器19
• 1.1.4 主要試劑配制19-20
• 1.1.5 統(tǒng)計學方法20
• 1.2 方法20-26
• 1.3 結果26-40
• 1.3.1 LN229, T98G, LN18細胞中耐藥蛋白MGMT的表達量26
• 1.3.2 TMZ-HE對LN229,T98G及LN-18細胞增殖抑制的作用26-29
• 1.3.3 TMZ-HE對LN229,T98G及LN-18細胞克隆形成的影響29-32
• 1.3.4 流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率和死亡率32-40
• 1.4 討論40-42
• 1.5 小結42-43
• 二、TMZ-HE對獲得性耐藥膠質瘤細胞系的增殖抑制作用43-51
• 2.1 對象和材料43-44
• 2.1.1 實驗對象43
• 2.1.2 實驗材料43
• 2.1.3 實驗儀器43
• 2.1.4 主要試劑配制43-44
• 2.1.5 統(tǒng)計學方法44
• 2.2 方法44-47
• 2.3 結果47-49
• 2.3.1 獲得性耐藥細胞系LN229/MGMT的建立47
• 2.3.2 獲得性耐藥細胞系SHG-44/TMZ的建立47-48
• 2.3.3 TMZ-HE對耐藥細胞系T98G, LN229-MGMT, SHG-44/TMZ細胞的增殖抑制作用48-49
• 2.4 討論49-50
• 2.5 小結50-51
• 三、TMZ-HE對惡性腦膠質瘤細胞抑制作用的機制51-61
• 3.1 對象和材料51-52
• 3.1.1 實驗對象51
• 3.1.2 實驗材料51
• 3.1.3 實驗儀器51-52
• 3.1.4 主要試劑配制52
• 3.1.5 統(tǒng)計學方法52
• 3.2 方法52-54
• 3.3 結果54-58
• 3.3.1 TMZ-HE導致LN229, T98G細胞中DNA損傷指標 γH2AX蛋白表達升高54-55
• 3.3.2 TMZ-HE能夠導致膠質瘤LN229, T98G細胞內(nèi)Bcl-2 蛋白表達降低、Bax蛋白表達增加55-56
• 3.3.3 TMZ-HE能夠使膠質瘤細胞發(fā)生S和G2期阻滯56-57
• 3.3.4 TMZ-HE能夠使T98G細胞中耐藥蛋白MGMT表達含量降低57-58
• 3.4 討論58-60
• 3.5 小結60-61
• 結論61-62
• 參考文獻62-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明67-68
• 綜述 有關替莫唑胺耐藥因素的研究進展68-77
• 綜述參考文獻74-77
• 致謝77

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