本文關(guān)鍵詞：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂體外定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞及其機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:分離并培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,鑒定細(xì)胞表型,在體外用單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并探索其最佳誘導(dǎo)濃度。方法:獲取新生兒臍帶,剔除臍動(dòng)、靜脈,將間質(zhì)組織剪成微小組織塊,用膠原酶消化后將臍帶組織置于含有胎牛血清、營(yíng)養(yǎng)因子、青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),原代細(xì)胞12小時(shí)后全量換液,24小時(shí)后半量換液,之后每3天換液一次,每次換液時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,貼壁情況,計(jì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度,并拍照記錄。當(dāng)觀察到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng),或排列成漩渦狀時(shí),加入胎牛血清終止消化,用胰蛋白酶消化后,按照1:2或1:3的比例傳代,記為P1。依次類推,記為P2,P3。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3,P5,P10代細(xì)胞作細(xì)胞,用胰酶消化,用PBS緩沖液漂洗后重懸為單細(xì)胞懸浮液,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度,以大于105個(gè)的量平均分裝于10個(gè)EP管中,滴加單克隆抗體CD73、CD90和CD105、CD19、CD34、CD45、CD11b和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠Ig G1-PE和Ig G1-FITC單克隆抗體作為同型對(duì)照。擴(kuò)增后,取第3代細(xì)胞,分為A、B、C、D、E 5組,前4組為實(shí)驗(yàn)組,E組為對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組各組GM1濃度分別為:A組50μg/m L、B組100μg/m L、C組150μg/m L、D組200μg/m L,誘導(dǎo)液用L-DMEM培養(yǎng)基配制,對(duì)照組只含L-DMEM培養(yǎng)基。觀察5組誘導(dǎo)液誘導(dǎo)h UMSCs的神經(jīng)分化的作用,每間隔1h觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)變化,于第6h用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)情況,并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率,結(jié)果以X±s表示。結(jié)果:可以從臍帶中分離并培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,原代培養(yǎng)的細(xì)胞在12h內(nèi)大部分細(xì)胞能貼壁,細(xì)胞呈菱形、多邊形,之后逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形細(xì)胞快速生長(zhǎng),并能穩(wěn)定的傳代,至第10代仍能保持旺盛的增殖能力。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀生長(zhǎng),并可見(jiàn)細(xì)胞因生長(zhǎng)密度過(guò)大造成脫落。用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞表型鑒定顯示P3、P5和P10代細(xì)胞均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD73、CD90和CD105,而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR,證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。誘導(dǎo)后1h,實(shí)驗(yàn)組各組均可見(jiàn)部分細(xì)胞胞體收縮為橢圓狀,兩端伸出突起,呈紡錘樣,以D組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量最多,A組最少;第2、3h各組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,突起伸長(zhǎng),以D組比率最高;第4h時(shí),A、B、C組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增加,表現(xiàn)為雙極或多極細(xì)胞,以雙極細(xì)胞為主,D組神經(jīng)樣細(xì)胞開(kāi)始脫落,比率不再增加;第5h時(shí),A、B組神經(jīng)樣細(xì)胞增加不明顯,可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落,C組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)目最多,也伴隨少量細(xì)胞脫落,D組神經(jīng)樣細(xì)胞呈片狀脫落,比率明顯下降;第6h時(shí),A、B組神經(jīng)樣細(xì)胞不再增加,C組神經(jīng)樣細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化,D組視野內(nèi)僅見(jiàn)少量未脫落的神經(jīng)樣細(xì)胞;E組誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化。誘導(dǎo)至第6小時(shí),免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組各組神經(jīng)樣細(xì)胞成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)呈陽(yáng)性表達(dá),而膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)陰性,150μg/m L組細(xì)胞的MAP-2、NF-H陽(yáng)性表達(dá)率最高。對(duì)照組誘導(dǎo)前后無(wú)明顯變化。結(jié)論:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以從臍帶組織中分離出來(lái)并可以穩(wěn)定的傳代,并表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志,單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂可以誘導(dǎo)h UMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,并表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H),150μg/m L為最合適誘導(dǎo)劑量。
【關(guān)鍵詞】：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 神經(jīng)樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8
• 材料與方法8-13
• 結(jié)果13-15
• 附圖15-23
• 附表23-24
• 討論24-26
• 結(jié)論26-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 綜述 間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化并治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展29-38
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 致謝38-39
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷39

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：685872