本文關(guān)鍵詞：MCM5在后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育中的作用及調(diào)控機制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 微小染色體維持蛋白 mcm5 面部運動神經(jīng)元 FGF信號通路 胚胎發(fā)育

【摘要】：目的微小染色體維持蛋白(MCM5,minichromosome maintenance proteins5)是微小染色體維持蛋白家族中的一員,在DNA的復(fù)制起始和延伸中扮演著重要的角色。MCM5表達(dá)量遠(yuǎn)大于細(xì)胞周期中DNA復(fù)制所必需的量,提示MCM5可能在胚胎發(fā)育中參與了DNA復(fù)制以外其他功能調(diào)控。mcm5可以通過參與DNA復(fù)制起始、延伸以及調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄影響生物的發(fā)育。本研究利用Morpholino方法降低mcm5的表達(dá),觀察mcm5缺失對后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育的影響,以及mcm5影響后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育的作用機制。本項目研究結(jié)果有助于對后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育分子調(diào)控機制的理解,為后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育缺陷所致面部運動性疾病的治療研究,提供理論依據(jù),同時也加深人們對細(xì)胞周期因子MCM5在細(xì)胞周期與細(xì)胞分化中雙重作用的認(rèn)識。方法采用Morpholino方法敲降mcm5,在胚胎發(fā)育到13hpf(hours post fertilizer),31hpf,48hpf利用解剖顯微鏡拍攝記錄,觀察胚胎外觀發(fā)育。胚胎發(fā)育到48hpf時,運用islet1抗體整胚免疫熒光顯色方法,標(biāo)記后腦面部運動神經(jīng)元。使用激光共聚焦拍攝記錄后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育。整胚原位雜交檢測mcm5功能性敲降后,胚胎發(fā)育到13體節(jié)時,FGF信號通路相關(guān)分子的表達(dá)。采用TUNEL染色法觀察mcm5功能敲降后,胚胎發(fā)育到48hpf時后腦細(xì)胞的凋亡。pH3抗體整胚免疫熒光顯色法,觀察胚胎發(fā)育到48hpf時,后腦細(xì)胞的增殖變化。實時熒光定量PCR(染料法),檢測凋亡相關(guān)基因,增殖相關(guān)基因的表達(dá)。構(gòu)建fgfr1a-pcs2+載體,體外轉(zhuǎn)錄制備正義mRNA,觀察fgfr1a mRNA是否可以援救mcm5 MO引起的后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育缺陷。結(jié)果(1)當(dāng)mcm5表達(dá)降低時,后腦腦室變小、中腦-后腦邊緣模糊。Islet1抗體整胚免疫熒光顯色,發(fā)現(xiàn)mcm5功能敲降后,后腦面部運動神經(jīng)元不能正常遷移。制備mcm5mrna與mcm5mo在胚胎一細(xì)胞期共同注射,發(fā)現(xiàn)mcm5mrna能夠回救mcm5mo造成的影響。說明mcm5特異的調(diào)控了后腦的發(fā)育與后腦面部運動神經(jīng)元的遷移。(2)mcm5功能性敲降后,fgf信號通路中配體fgf8表達(dá)升高,受體fgfr1a及其下游分子pea3表達(dá)降低。mcm5mrna能夠援救由于mcm5mo敲降所引起的fgf信號通路相關(guān)分子表達(dá)紊亂。通過tg(hsp70:dnfgfr-gfp)轉(zhuǎn)基因魚,將其胚胎在80%原腸外包時熱激表達(dá)dnfgfr-gfp(非功能性的fgfr)以競爭性降低fgfr活性發(fā)現(xiàn),當(dāng)fgfr活性降低后,fgf8和pea3表達(dá)分別上升和降低,這表明fgfr信號活性降低反向調(diào)控導(dǎo)致fgf8表達(dá)增加。實驗證實mcm5在胚胎后腦發(fā)育過程中調(diào)控了fgf信號活性,并且是在fgf信號途徑受體或更下游層次上調(diào)控fgf信號。(3)mcm5功能性敲降后,tunel染色發(fā)現(xiàn)后腦細(xì)胞凋亡無明顯變化,凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化不具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明mcm5可能并不通過調(diào)控細(xì)胞凋亡,影響后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育。(4)mcm5功能性敲降后,后腦增殖細(xì)胞減少,增殖相關(guān)基因表達(dá)下降,且mcm5mrna能夠援救mcm5mo造成的缺陷。說明mcm5可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖,參與后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育。(5)fgfr1amo能夠模擬mcm5mo對后腦面部運動神經(jīng)元造成的發(fā)育缺陷,并且fgfr1amo造成的后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育缺陷更為嚴(yán)重,不僅面部運動神經(jīng)元遷移困難,而且神經(jīng)元數(shù)量減少。制備fgfr1amrna與mcm5mo在胚胎一細(xì)胞期共注射,發(fā)現(xiàn)fgfr1amrna能夠援救mcm5造成的面部運動神經(jīng)元遷移困難,而mcm5mrna不能援救fgfr1amo引起的面部運動神經(jīng)元的發(fā)育缺陷。結(jié)合第二部分實驗數(shù)據(jù)可知,mcm5通過對fgfr1a表達(dá)的調(diào)控,影響后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育。結(jié)論mcm5表達(dá)降低,導(dǎo)致胚胎后腦腦室變小,中腦-后腦邊緣模糊,后腦面部運動神經(jīng)元遷移困難,但后腦細(xì)胞凋亡并未增加,凋亡相關(guān)基因表達(dá)也無明顯變化。然而mcm5功能敲降后,后腦細(xì)胞增殖減少,增殖相關(guān)基因表達(dá)降低。FGF信號通路中配體fgf8表達(dá)升高,fgfr1a,pea3表達(dá)降低。特異敲降fgfr1a,能夠模擬mcm5表達(dá)降低后,后腦面部運動神經(jīng)元造成的發(fā)育缺陷,并且fgfr1a MO造成的后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育缺陷更為嚴(yán)重,不僅面部運動神經(jīng)元遷移困難,而且神經(jīng)元數(shù)量減少。制備fgfr1a mRNA與mcm5MO在胚胎一細(xì)胞期共注射,發(fā)現(xiàn)fgfr1a mRNA能夠援救mcm5造成的面部運動神經(jīng)元遷移困難,而mcm5 mRNA不能援救fgfr1a MO引起的面部運動神經(jīng)元的發(fā)育缺陷。以上結(jié)果均表明mcm5并不通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡影響后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育。而是通過影響細(xì)胞的增殖,以及調(diào)節(jié)FGF信號通路中fgfr1a的表達(dá),參與對后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：微小染色體維持蛋白 mcm5 面部運動神經(jīng)元 FGF信號通路 胚胎發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 MCM5在后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育中的作用16-24
• 1 引言16-17
• 2 材料與方法17-20
• 2.1 實驗動物及飼養(yǎng)17
• 2.2 試劑、耗材和儀器17-18
• 2.3 培養(yǎng)基和主要試劑的配制18-19
• 2.4 實驗方法19-20
• 3 實驗結(jié)果20-23
• 3.1 mcm5基因功能敲降導(dǎo)致后腦發(fā)育異常20-21
• 3.2 mcm5 mRNA援救mcm5 MO導(dǎo)致的后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育缺陷21-23
• 4 討論23
• 5 小結(jié)23-24
• 第二部分 MCM5可能不經(jīng)凋亡途徑調(diào)控后腦面部運動神經(jīng)元的發(fā)育24-31
• 1 引言24
• 2 材料與方法24-28
• 2.1 實驗動物及飼養(yǎng)24
• 2.2 試劑、耗材和儀器24
• 2.3 實驗方法24-28
• 3 實驗結(jié)果28-29
• 3.1 mcm5功能敲降，后腦面部運動神經(jīng)元凋亡未增多28
• 3.2 凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平無明顯變化28-29
• 4 討論29-30
• 5 小結(jié)30-31
• 第三部分 MCM5可能通過細(xì)胞增殖調(diào)控后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育31-36
• 1 引言31
• 2 材料與方法31-33
• 2.1 實驗動物及飼養(yǎng)31
• 2.2 試劑、耗材和儀器31-32
• 2.3 實驗方法32-33
• 3 實驗結(jié)果33-34
• 3.1 mcm5功能性敲降后，后腦增殖細(xì)胞減少33-34
• 3.2 增殖相關(guān)基因表達(dá)異常34
• 4 討論34-35
• 5 小結(jié)35-36
• 第四部分 FGF信號介導(dǎo)MCM5調(diào)控后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育36-51
• 1 引言36-37
• 2 材料與方法37-44
• 2.1 實驗動物及飼養(yǎng)37
• 2.2 試劑、耗材和儀器37
• 2.3 原位雜交相關(guān)試劑的配制37-38
• 2.4 實驗方法38-44
• 3 實驗結(jié)果44-48
• 3.1 mcm5 mRNA援救由mcm5 MO所引起的FGF信號通路異常44-46
• 3.2 FGFR1A功能下調(diào)反向調(diào)控增加fgf8表達(dá)46-47
• 3.3 fgfr1a MO模擬了mcm5MO所致的后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育缺陷47
• 3.4 fgfr1amRNA援救mcm5MO所致后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育缺陷47-48
• 4 討論48-49
• 5 小結(jié)49-51
• 全文總結(jié)51-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 文獻(xiàn)綜述57-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 附錄66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果67-68
• 致謝68

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