本文關鍵詞：miR-27a作用于Wnt信號通路促進顱咽管瘤鈣化的相關研究

  更多相關文章： 顱咽管瘤 造釉細胞型顱咽管瘤 鱗狀乳頭型顱咽管瘤 miR-27a Wnt/β-catenin信號通路 鈣化

【摘要】：研究背景及目的顱咽管瘤是由外胚葉形成的顱咽管細胞發(fā)展而來的一種常見的胚胎殘余上皮源性腫瘤,是兒童顱內最常見的先天性腫瘤,占兒童顱內腫瘤的12-14%,占兒童鞍區(qū)腫瘤的50%以上。顱咽管瘤最早是由奧地利的Erdheim教授于1904年首次提出其與胚胎的咽鼓管相關,并將其作為一類單獨的鞍區(qū)腫瘤進行描述。其后是1932年美國的Cushing教授在書中第一次以”顱咽管瘤”為名稱對此類腫瘤進行了比較詳細的描述,從而確立了其命名,并一直沿用至今天。顱咽管瘤在病理組織學上屬于良性腫瘤(WHO I級),其主要的病理組織類型可分為兩種亞型：造釉細胞型顱咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma ACP)和鱗狀乳頭型顱咽管瘤(papillary craniopharyngioma PCP),前者好發(fā)于兒童患者,多表現(xiàn)為囊性或者囊性為主的囊實性的病變,大多數(shù)腫瘤影像學上可見鈣化,在兒童患者中鈣化出現(xiàn)的比例甚至超過80%,術中可見腫瘤與周圍組織粘連嚴重,而后者以成人多見,實性腫瘤較多,影像學檢查罕見鈣化,與周圍重要結構的炎性粘連也較輕,術后病理資料也證實：造釉細胞型顱咽管瘤多發(fā)生鈣化,而鱗狀乳頭型顱咽管瘤基本上不發(fā)生鈣化。在影響顱咽管瘤手術治療及預后的眾多危險因素當中,鈣化是其中較為重要的一個。目前大量臨床資料表明,顱咽管瘤的鈣化灶常常與腫瘤周圍的重要組織結構包括垂體柄、視交叉、三腦室底等粘連緊密,手術中對其完整剝離存在一定困難,增加了腫瘤手術全切除的難度。手術治療中如果要對顱咽管瘤進行全切除,完整剝離鈣化灶,有可能損傷周圍重要的組織結構導致患者術后并發(fā)癥嚴重,嚴重影響患者的預后和生活質量,而若不完整剝離粘連的鈣化灶,僅對腫瘤行部分切除,則大大增加了患者術后腫瘤的復發(fā)率。因此較好的全切除顱咽管瘤并盡量不損傷其周圍重要結構一直是神經(jīng)外科醫(yī)生面臨的難題。經(jīng)典的Wnt信號傳導通路是指由Wnt信號蛋白與細胞表面Frizzled(FZD)受體家族結合而后導致一系列反應,其中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號傳導通路中的關鍵因子,β-catenin在細胞質中表達量最多,也可存在于細胞膜及細胞核中。當Wnt信號通路未激活時,存在于細胞質中的β-catenin與APC、AXIN、GSK-3β等蛋白因子形成的降解復合體結合在一起,β-catenin被降解復合體中的因子磷酸化。經(jīng)磷酸化后的β-catenin隨即通過啟動的β-轉導重復相容蛋白(β-TrCP)介導泛素／蛋白酶體途徑在細胞質中被降解。而當Wnt信號通路被激活時,β-catenin從降解復合體中逃離出來并大量在細胞質內積聚,其中一部分可通過核膜孔進入細胞核內與LFF/TCF結合,從而激活下游基因的表達,在腫瘤的發(fā)生及多種生物學行為中扮演重要角色。造釉型顱咽管瘤被證實存在β-catenin基因CTNNB1的突變導致Wnt信號通路的激活,而在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中不存在這種突變,Wnt信號通路的激活參與造釉型顱咽管瘤的發(fā)生,但其與腫瘤的多種表現(xiàn)包括炎癥、鈣化、囊腫形成等的關系及作用機理還不十分清楚。小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼蛋白質的單鏈小RNA分子,由大約22個核苷酸組成,在進化過程中高度保守。miR-27是小RNA家族中功能比較顯著的一種,目前發(fā)現(xiàn)人類存在有miR-27a、miR-27b兩種亞型,大量的研究發(fā)現(xiàn)miR-27在人體多種疾病比如乳腺癌、結腸癌、胰腺癌及胃腺癌等腫瘤中的表達較正常組織顯著上調,在這些疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用,此外,miR-27在成牙質細胞和成骨細胞分化過程中的起重要作用,可以促進牙質和骨化的形成。并且證實miR-27在人骨髓間充質干細胞(humanmesenchymalstemcells,hMSC)轉化為骨細胞的過程中可通過抑制Wnt信號通路中的APC基因的表達,引起細胞質內β-catenin的大量積累而進入細胞核內,激活Wnt信號通路從而影響骨細胞的分化。而下調miR-27表達可促進β-catenin在細胞質中的降解,誘導成骨細胞凋亡,造成骨質疏松。此外,miR-27也可作用于骨成型蛋白信號通路中的BMPR2基因,促進成骨細胞的分化。顱咽管瘤是起源于原始口腔外胚層形成的顱咽管殘余上皮細胞,目前組織學上認為造釉細胞型顱咽管瘤與牙源性上皮腫瘤存在較大的相似性,并且牙源性組織所特有的釉質蛋白在造釉細胞型顱咽管瘤中的表達也已得到確認,而在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中則沒有發(fā)現(xiàn)表達。miR-27可作用于Wnt信號通路引起β-catenin的入核促進牙質的形成和骨細胞的分化,在顱咽管瘤尤其是造釉細胞型顱咽管瘤中miR-27的表達及其與Wnt信號通路的激活對顱咽管瘤鈣化形成的作用機理仍不十分明確,有待進一步的研究發(fā)現(xiàn)。本研究主要通過檢測miR-27a和β-catenin在顱咽管瘤中的表達情況,明確Wnt信號通路的激活與鈣化的關系,并且采用上調miR-27a在顱咽管瘤細胞中表達的方法,然后檢測Wnt信號通路關鍵因子β-catenin表達的變化及鈣化相關蛋白ALP,BMP2的表達情況,尋找miR-27a作用于Wnt信號通路促進顱咽管瘤鈣化的證據(jù),初步探討顱咽管瘤鈣化的形成機制。研究內容與方法1. p-catenin和miR-27a在顱咽管瘤中的表達。收集南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院神經(jīng)外科2013年4月至2014年10月經(jīng)病理確診為顱咽管瘤的標本33例,其中造釉型顱咽管瘤27例,鱗狀乳頭型顱咽管瘤6例,以上病例均有完整的術前,術后影像學及臨床資料。實驗方法：采用免疫組化的方法檢測不同病理和鈣化等級顱咽管瘤標本中β-catenin表達情況,并分析β-catenin表達與病理類型和鈣化級別的相關性,進一步運用Westem blot的方法檢測顱咽管瘤組織中β-catenin表達水平,分析其表達量與病理類型及鈣化級別的相關性；利用RT-PCR的方法檢測miR-27a在不同病理類型及鈣化級別的顱咽管瘤組織中的表達量,分析其與顱咽管瘤病理類型及鈣化級別之間的關系。2. miR-27a通過作用于Wnt信號通路促進顱咽管瘤鈣化的初步研究通過上述方法取得的新鮮顱咽管瘤標本,取腫瘤組織的實體部分進行顱咽管瘤細胞的原代培養(yǎng),得到顱咽管瘤的細胞模型并驗證。通過瞬時轉染上調miR-27a的顱咽管瘤細胞作為實驗組(miR-27a+),設置空白對照組,通過qRT-PCR的方法檢測miRNA的表達水平來確認轉染成功,相同的條件下培養(yǎng)72小時后進一步采用Westem blot檢測每組細胞內β-catenin蛋白和鈣化相關蛋白BMP2, ALP的表達水平,最后通過茜素紅染色的方法檢測每組細胞的鈣鹽沉積情況,為進一步驗證上述試驗的結果,取上調miR-27a成功的腫瘤細胞,實驗組加入Wnt信號通路阻斷劑,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72小時,再次通過Western blot的方法驗證試驗組和空白對照組鈣化相關蛋白ALP, BMP2的表達水平。3.統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料用x±s表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗、不同鈣化級別間多重比較采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)。以P0.05表示具有統(tǒng)計學差異。結果1. β-catenin和miR-27a在顱咽管瘤中的表達以及其與顱咽管瘤不同病理類型及鈣化分級的關系。運用免疫組化方法檢測不同顱咽管瘤組織中β-catenin的表達水平,結果顯示造釉細胞型顱咽管瘤組織的標本中β-catenin的表達強度高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤,并且造釉細胞型顱咽管瘤組織標本中可見β-catenin在細胞核內表達,其中造釉細胞型顱咽管瘤存在β-catenin細胞核表達細胞常出現(xiàn)于渦旋狀細胞及鈣化灶區(qū)域周邊細胞。而鱗狀乳頭型顱咽管瘤的組織標本中β-catenin多表達于細胞膜上,未發(fā)現(xiàn)其在細胞核中表達。進一步采用western blot的方法對所有顱咽管瘤組織中β-catenin的表達進行檢測,結果顯示造釉型顱咽管瘤組織中β-catenin蛋白的表達水平高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤(P=0.013,0.05)；并且在造釉細胞型顱咽管瘤組織中β-catenin蛋白的表達與鈣化的級別有較高的一致性(rs=0.791,P0.001),鈣化級別高的顱咽管瘤組織β-catenin蛋白的表達水平也較高,而未見鈣化的造釉細胞型顱咽管瘤β-catenin的表達水平和鱗狀乳頭型顱咽管瘤的表達無統(tǒng)計學意義(P=0.237)。利用qRT-PCR技術檢測顱咽管瘤組織中的miR-27a的表達水平,結果顯示造釉細胞型顱咽管瘤組織標本中miR-27a的表達水平要高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤(P值為0.024,0.05),并且在造釉細胞型顱咽管瘤組織中miR-27a的表達水平在不同鈣化級別分組中的表達差異具有統(tǒng)計學意義(p值均0.05),隨著鈣化級別的升高,miR-27a的表達水平也升高(rs=0.680,P0.001)。而在未發(fā)生鈣化的造釉細胞型顱咽管瘤中·miR-27a的表達與在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中的表達差異無統(tǒng)計意義(P值=0.31)。2. miR-27a通過作用于Wnt信號通路促進顱咽管瘤鈣化的研究用qRT-PCR進行顱咽管瘤細胞miR-27a的表達檢測,轉染實驗組(miR-27a+)表達水平高于空白對照組,驗證轉染成功。采用Western blot檢測實驗組和對照組細胞內β-catenin和鈣化相關蛋白BMP2, ALP的表達水平,結果顯示實驗組細胞內β-catenin和鈣化相關蛋白BMP2, ALP的表達水平均高于對照組(P值均0.05)；茜素紅染色結果顯示實驗組的鈣鹽沉積明顯較對照組多.為進一步驗證上述試驗結果,利用Westem blot檢測Wnt信號阻斷實驗組(Wnt-)和對照組細胞內β-catenin和鈣化相關蛋白BMP2,ALP的表達水平,結果顯示實驗組細胞內鈣化相關蛋白BMP2,ALP的表達水平均低于對照組(P值均0.05)。結論miR-27a和Wnt信號通路的激活在顱咽管瘤的鈣化過程中扮演了重要的角色。在造釉細胞型顱咽管瘤中miR-27a的表達可促進顱咽管瘤細胞的鈣化,這種促進作用是通過作用于Wnt信號通路產(chǎn)生的。阻斷Wnt信號通路的激活可以抑制這種促進作用。miR-27a激活Wnt信號通路促進顱咽管瘤細胞的鈣化是顱咽管瘤鈣化形成的可能機制之一,Wnt信號通路的激活后作用于目的基因促進顱咽管瘤細胞的鈣化的具體機制還需要進一步進行研究。
【關鍵詞】：顱咽管瘤 造釉細胞型顱咽管瘤 鱗狀乳頭型顱咽管瘤 miR-27a Wnt/β-catenin信號通路 鈣化
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-21
• 第一章 miR-27a和β-catenin在顱咽管瘤中的表達21-37
• 一 引言21-22
• 二 材料與方法22-31
• 三 結果31-37
• 第二章 miR-27a通過作用于Wnt信號通路促進顱咽管瘤鈣化的研究37-50
• 一 引言37
• 二 材料與方法37-46
• 三 結果46-50
• 全文討論50-54
• 總結54-55
• 參考文獻55-61
• 英文縮寫詞簡表61-63
• 攻讀學位期間成果63-64
• 致謝64-66

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王志利;侯林生;;常用鎖孔手術入路的解剖學和臨床應用研究[J];河南外科學雜志;2011年06期

2 王小飛;王志剛;;顱咽管瘤手術治療現(xiàn)狀及進展[J];臨床神經(jīng)外科雜志;2013年05期

3 黃廣龍;吳欣洪;郭邦明;漆松濤;;顱咽管瘤組織中IFN-α、IFN-αR、OPN的表達變化及意義[J];山東醫(yī)藥;2012年30期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 潘軍;顱咽管瘤的外科學分型及其在顯微手術中的應用研究[D];第一軍醫(yī)大學;2007年

2 周杰;釉質上皮型顱咽管瘤實驗模型建立及IL-6對釉質上皮型顱咽管瘤細胞體外遷移特性的影響[D];南方醫(yī)科大學;2012年

3 常洪波;應用~(32)P膠體治療顱咽管瘤臨床安全性及體外實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 宗慶華;經(jīng)額縱裂入路及鞍區(qū)的顯微解剖學研究[D];鄭州大學;2010年

2 王小飛;顯微手術治療顱咽管瘤回顧性臨床分析[D];山東大學;2009年

3 韓獎勵;CT成像模擬眶上鎖孔入路磨除前床突前后頸內動脈床突上段的顯露[D];中南大學;2010年

，

本文編號：643101