本文關(guān)鍵詞：HDAC6在異常聚集tau蛋白的降解過(guò)程中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 組蛋白去乙酰化酶6 tau蛋白 泛素鋅指結(jié)合域 自噬-溶酶體系統(tǒng)

【摘要】：Tau蛋白的異常病理性聚集是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等神經(jīng)退行性疾病的重要病理學(xué)標(biāo)志之一。研究異常tau蛋白的降解機(jī)制對(duì)于AD等tau蛋白相關(guān)疾病的治療具有重要臨床指導(dǎo)意義。細(xì)胞內(nèi)短期和可溶性低分子量蛋白質(zhì)主要經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)進(jìn)行降解。然而,在tau相關(guān)疾病中,蛋白酶體普遍存在功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的tau蛋白不能經(jīng)UPS進(jìn)行有效清除。組蛋白去乙酰化酶6 (Histone deacetylase 6, HDAC6)可與泛素化底物蛋白結(jié)合,在動(dòng)力蛋白的參與下將底物蛋白沿著微管運(yùn)輸?shù)轿⒐芙M織中心(microtubule organizing center, MTOC)形成功能性蛋白質(zhì)聚集體(aggresome),并激活自噬-溶酶體途徑,最終使得含有底物蛋白的聚集體結(jié)構(gòu)經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解。因此,自噬途徑在蛋白酶體活性抑制時(shí)對(duì)于維持胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量恒定具有重要的代償意義。HDAC6的泛素鋅指結(jié)合域(binder of ubiquitin zinc finger domain, BUZ)可與單體泛素以及多聚泛素鏈結(jié)合,且已有的研究表明,HDAC6可介導(dǎo)tau蛋白聚集體的形成,但具體機(jī)制尚不明確。因此,我們推測(cè)蛋白酶體活性抑制時(shí),可介導(dǎo)泛素化tau蛋白含量的增加,而HDAC6通過(guò)其BUZ結(jié)構(gòu)域與泛素化tau蛋白結(jié)合,介導(dǎo)tau蛋白聚集體的形成,并通過(guò)激活自噬-溶酶體途徑促進(jìn)tau蛋白的降解。目的：利用蛋白酶體抑制劑MG132處理小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(mouse neuroblastoma N2a cells, Neuro-2a),誘導(dǎo)泛素化tau蛋白質(zhì)的聚集,探討HDAC6對(duì)異常聚集tau蛋白降解的作用及機(jī)制。方法：(1)用siRNA方法抑制N2a細(xì)胞中HDAC6的表達(dá),通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)HDAC6 siRNA處理對(duì)HDAC6含量的影響；(2)用siRNA方法抑制N2a細(xì)胞中HDAC6的表達(dá),6hr后分別轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6和FLAG-HDAC6 ΔBUZ質(zhì)粒36 hr,免疫印跡技術(shù)檢測(cè)質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功；(3)用siRNA方法抑制N2a細(xì)胞中HDAC6的表達(dá),6hr后分別轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6和FLAG-HDAC6 ABUZ質(zhì)粒,36hr后利用MG132 (5μM)處理N2a細(xì)胞24 hr,抑制蛋白酶體功能,免疫印跡技術(shù)檢測(cè)tau蛋白含量變化；(4)在(3)的條件下用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)自噬活性標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)；(5)向N2a細(xì)胞內(nèi)分別共轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6和EGFP-tau、FLAG-HDAC6 ABUZ和EGFP-tau質(zhì)粒,36 hr后用MG132 (5μM)分別處理細(xì)胞12 hr和24 hr,免疫熒光技術(shù)觀察HDAC6和tau在細(xì)胞中的定位關(guān)系和tau蛋白功能性聚集體的形成情況；(6)在(5)的條件下,利用免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)HDAC6和tau蛋白的相互作用。結(jié)果：(1)用20 nM的HDAC6 siRNA處理N2a細(xì)胞6hr, N2a細(xì)胞中HDAC6表達(dá)下降最明顯,達(dá)80%(P0.001)。(2) FLAG抗體檢測(cè)FLAG-HDAC6 和 FLAG-HDAC6 ΔBUZ質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FLAG-HDAC6與FLAG-HDAC6ΔBUZ轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中,FLAG表達(dá)水平明顯增加。(3)與對(duì)照組相比,MG132處理組細(xì)胞中tau蛋白含量上升(P0.05)；與MG132處理組相比,FLAG-HDAC6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中tau蛋白含量顯著性降低(P0.05)；與FLAG-HDAC6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,FLAG-HDAC6 ABUZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中tau蛋白含量則顯著增加(P0.05)。(4)與對(duì)照組相比,MG132處理組細(xì)胞中自噬活性標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)上調(diào)(P0.05)；與MG132處理組相比,FLAG-HDAC6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中LC3表達(dá)顯著增加(P0.05)；與FLAG-HDAC6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,FLAG-HDAC6 ΔBUZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中LC3表達(dá)則明顯降低(P0.05)。(5)與對(duì)照組相比,MG132處理組HDAC6與tau蛋白向核周聚集,并出現(xiàn)tau蛋白聚集體,HDAC6和tau具有較好的共定位關(guān)系；與共轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6和EGFP-tau質(zhì)粒組相比,共轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6 ΔBUZ和EGFP-tau組細(xì)胞中,tau蛋白散在分布于胞漿中,無(wú)tau蛋白聚集體形成,HDAC6與tau蛋白的共定位消失。(6)與對(duì)照組相比,MG132處理組HDAC6與tau蛋白之間結(jié)合增強(qiáng)(P0.05)；與共轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6和EGFP-tau組細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染FLAG-HDAC6和EGFP-tau ΔBUZ組細(xì)胞中,HDAC6與tau蛋白之間結(jié)合減弱(P0.05)。結(jié)論：以上結(jié)果表明,蛋白酶體活性抑制時(shí),HDAC6通過(guò)增強(qiáng)與tau蛋白的結(jié)合,參與tau蛋白聚集體的形成,并通過(guò)激活自噬-溶酶體途徑使tau蛋白得到有效降解。本研究以N2a細(xì)胞為模型,初步探討了HDAC6在蛋白酶體活性抑制時(shí)參與tau蛋白降解的途徑及機(jī)制,為進(jìn)一步明確HDAC6在tau蛋白經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解中發(fā)生的作用及機(jī)制提供了較好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：組蛋白去乙�；�6 tau蛋白 泛素鋅指結(jié)合域 自噬-溶酶體系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1. 前言12-22
• 1.1 微管相關(guān)蛋白tau及相關(guān)疾病12-14
• 1.1.1 Tau蛋白的結(jié)構(gòu)與功能12-14
• 1.1.2 Tau蛋白相關(guān)疾病14
• 1.2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)14-15
• 1.2.1 組成成分及功能14-15
• 1.2.2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)tau蛋白的降解15
• 1.3 自噬-溶酶體系統(tǒng)15-16
• 1.3.1 自噬-溶酶體系統(tǒng)15-16
• 1.3.2 自噬-溶酶體系統(tǒng)對(duì)tau蛋白的降解16
• 1.4 組蛋白去乙�；�6(HDAC6)16-21
• 1.4.1 HDACs家族16-17
• 1.4.2 HDAC6的結(jié)構(gòu)與功能17-18
• 1.4.3 HDAC6與tau蛋白的相互作用關(guān)系18
• 1.4.4 HDAC6對(duì)蛋白質(zhì)降解過(guò)程的調(diào)控18-20
• 1.4.5 泛素鋅指結(jié)合域(binder of ubiquitin zinc finger domain,BUZ)20-21
• 1.5 本研究的目的及意義21-22
• 2. 材料與方法22-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器22
• 2.2 化學(xué)試劑及抗體22-23
• 2.2.1 主要化學(xué)試劑22-23
• 2.2.2 抗體23
• 2.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)23
• 2.4 HDAC6 siRNA23-24
• 2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24
• 2.6 細(xì)胞加藥處理24-25
• 2.7 免疫印跡25-26
• 2.7.1 蛋白質(zhì)樣品制備25
• 2.7.2 SDS-PAGE凝膠電泳25-26
• 2.7.3 轉(zhuǎn)膜26
• 2.7.4 顯色26
• 2.8 免疫沉淀26-27
• 2.9 免疫熒光27-28
• 2.10 數(shù)據(jù)分析28-29
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-35
• 3.1 HDAC6 siRNA處理對(duì)內(nèi)源性HDAC6表達(dá)的影響29
• 3.2 外源性FLAG-HDAC6和FLAG-HDAC6ΔBUZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)29-30
• 3.3 蛋白酶體活性抑制時(shí),HDAC6對(duì)tau蛋白含量的影響30-31
• 3.4 蛋白酶體活性抑制時(shí),表達(dá)外源性HDAC6可促進(jìn)自噬途徑的激活31-32
• 3.5 蛋白酶體活性抑制時(shí),tau與HDAC6的共定位增強(qiáng)及tau蛋白聚集體的形成32-33
• 3.6 蛋白酶體活性抑制時(shí),tau蛋白與HDAC6結(jié)合增強(qiáng)33-35
• 4. 討論35-39
• 4.1 HDAC6對(duì)tau蛋白含量的影響35-36
• 4.2 HDAC6對(duì)自噬活性的影響36
• 4.3 HDAC6對(duì)tau蛋白功能性聚集體形成的影響36-37
• 4.4 HDAC6與tau蛋白的相互作用37-39
• 5. 結(jié)論與展望39-41
• 參考文獻(xiàn)41-48
• 附錄48-49
• 在攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文49-50
• 致謝50

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5 張h，

本文編號(hào)：621075