發(fā)布時間：2017-07-21 01:00

  本文關(guān)鍵詞：新生期反復(fù)驚厥性腦損傷中生酮飲食的調(diào)節(jié)作用及信號通路研究

  更多相關(guān)文章： 生酮飲食 新生期驚厥 自噬 Beclin-1 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62 cPLA2

【摘要】：目的:探討生酮飲食長期應(yīng)用對三氟乙醚誘導(dǎo)的大鼠新生期反復(fù)驚厥性腦損傷的調(diào)節(jié)作用及對腦內(nèi)信號通路的影響。方法:采用隨機數(shù)表法將48只8日齡(P8表示,下同)的Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分成兩組:對照組(NS組)和驚厥組(RS組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)一天后,驚厥組大鼠通過三氟乙醚反復(fù)吸入誘導(dǎo)新生期反復(fù)驚厥發(fā)作,每次驚厥持續(xù)30min,每日一次,連續(xù)驚厥8天,對照組中除不吸入三氟乙醚外其他處理相同。P20天依據(jù)是否需要生酮飲食干預(yù),將每組大鼠再隨機分成兩組,即:單純對照組(NS+ND組)、生酮飲食組(NS+KD組)、單純驚厥組(RS+ND組)、驚厥+生酮飲食組(RS+KD組),每組12只。各組大鼠斷奶并禁飲食一天后,于P21天開始飲食干預(yù),NS+ND組及RS+ND組給予正常飲食,NS+KD組及RS+KD組給予生酮飲食,飲食干預(yù)三周。于P21、P28、P35、P42天監(jiān)測血酮及血糖的變化,實驗期間定期監(jiān)測大鼠體重變化。于P28、P35天進行神經(jīng)反射評測(平面翻正試驗、懸崖回避試驗、前肢懸吊試驗、負向趨地試驗),P35天進行曠場試驗,于P37-43天期間行Morris水迷宮測試。P43天水迷宮結(jié)束后分離大腦皮質(zhì)和海馬組織,免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測Cathepsin E、CLU、Beclin-1、Bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、c PLA2的表達。Neo-Timm’s染色檢測海馬苔蘚纖維發(fā)芽。結(jié)果:1.體重變化:四組大鼠體重存在顯著的組間差異[F(3,33)=383.9,P0.0001],進一步比較發(fā)現(xiàn),P21-P43期間各監(jiān)測時間點RS+ND組大鼠體重較NS+ND組明顯降低(P0.05);P25-P43各個監(jiān)測時間點NS+KD組大鼠體重較NS+ND組明顯降低(P0.05);P25-P43各個監(jiān)測時間點,RS+KD組較RS+ND組大鼠體重明顯降低(P0.05)。2.神經(jīng)行為:(1)平面翻正試驗:P28天四組大鼠平面翻正時間無顯著性差異(F=1.590,P=0.2050.05);P35天四組間無顯著性差異(F=1.200,P=0.3210.05)。(2)懸崖回避試驗:P28天四組大鼠懸崖回避時間無顯著性差異(F=2.245,P=0.0960.05);P35天四組間有顯著性差異(F=11.740,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯延長(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯縮短(P0.05)。(3)前肢懸吊試驗:P28天四組大鼠前肢懸吊時間無顯著性差異(F=2.017,P=0.1250.05);P35天四組間有顯著性差異(F=7.355,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND明顯縮短(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯延長(P0.05)。(4)負向趨地試驗:P28天四組大鼠負向趨地時間有顯著性差異(F=7.362,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯延長(P0.05),RS+KD組時間較RS+ND組明顯縮短(P0.05);P35天四組間有顯著性差異(F=10.961,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯延長(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯縮短(P0.05)。(5)曠場試驗:四組大鼠延遲時間有顯著性差異(F=23.961,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯延長(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯縮短(P0.05);四組大鼠水平得分有顯著性差異(F=7.290,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯減少(P0.05),RS+KD組與RS+ND組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);四組大鼠垂直得分有顯著性差異(F=4.858,P=0.0050.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯減少(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯增加(P0.05);四組大鼠開場得分有顯著性差異(F=7.785,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組較NS+ND組明顯減少(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯增加(P0.05);四組大鼠修飾次數(shù)無顯著性差異(F=0.391,P=0.7600.05);四組大鼠大便粒數(shù)有顯著性差異(F=14.625,P=0.0000.05),兩兩比較,RS+ND組大便顆粒數(shù)較NS+ND組增多(P0.05),RS+KD組較RS+ND組減少(P0.05)。3.Morris水迷宮:(1)定位航行試驗:重復(fù)測量雙因素方差分析(repeated two way ANOVA)結(jié)果顯示:四組大鼠逃避潛伏期存在組間顯著性差異[F(3,33)=11.79,P0.0001]、訓(xùn)練天數(shù)間顯著性差異[F(4,44)=13.34,P0.0001]以及組間因素與訓(xùn)練天數(shù)因素之間顯著的交互作用[F(12,132)=2.661,P=0.0031],進一步的比較發(fā)現(xiàn),第2天開始RS+ND組及RS+KD組時間均較NS+ND組延長,RS+ND組與NS+ND組在第3、4、5天均存在顯著性差異(P0.05),而RS+KD組與NS+ND組僅在第4天存在顯著性差異(P0.05)。(2)空間探索實驗:四組大鼠穿越平臺次數(shù)有顯著性差異(F=6.478,P=0.0010.05),兩兩比較,穿越平臺次數(shù)RS+ND組較NS+ND組明顯減少(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯增加(P0.05)。4.Neo-Timm’s染色結(jié)果:四組大鼠海馬CA3區(qū)苔蘚纖維異常發(fā)芽半定量評分有顯著性差異(F=27.652,P=0.0000.05),兩兩比較,苔蘚纖維異常發(fā)芽程度RS+ND組較NS+ND組明顯增高(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯降低(P0.05);四組大鼠海馬齒狀回苔蘚纖維異常發(fā)芽半定量評分有顯著性差異(F=9.809,P=0.0000.05),兩兩比較,苔蘚纖維異常發(fā)芽程度RS+ND組較NS+ND組明顯增高(P0.05),RS+KD組較RS+ND組明顯降低(P0.05)。5.Western blot結(jié)果:(1)四組大鼠大腦皮層組織Cathepsin E表達有顯著性差異(F=5.377,P=0.0070.05),兩兩比較,RS+ND組Cathepsin E表達較NS+ND組明顯增高(P0.05),RS+KD組Cathepsin E表達較RS+ND組明顯降低(P0.05);四組大鼠海馬組織中Cathepsin E表達有顯著性差異(F=9.167,P=0.0010.05),兩兩比較,RS+ND組Cathepsin E表達較NS+ND組明顯增高(P0.05),RS+KD組Cathepsin E表達較RS+ND組明顯降低(P0.05)。(2)四組大鼠大腦皮層CLU表達有顯著性差異(F=3.340,P=0.0400.05),兩兩比較,RS+ND組CLU表達較NS+ND組明顯升高(P0.05),RS+KD組CLU表達較RS+ND組明顯降低(P0.05);四組大鼠海馬組織中CLU表達有顯著性差異(F=6.139,P=0.0040.05),兩兩比較,RS+ND組CLU表達較NS+ND組明顯升高(P0.05),RS+KD組CLU表達較RS+ND組明顯降低(P0.05)。(3)四組大鼠大腦皮層Beclin-1表達無顯著性差異(F=0.697,P=0.5650.05);四組大鼠海馬組織中Beclin-1表達有顯著性差異(F=3.186,P=0.0460.05),兩兩比較,RS+ND組Beclin-1表達較NS+ND組明顯升高(P0.05),其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)四組大鼠大腦皮層Bcl-2表達無顯著性差異(F=1.695,P=0.2000.05);四組大鼠海馬Bcl-2表達無顯著性差異(F=0.929,P=0.4450.05)。(5)四組大鼠大腦皮層Beclin-1/Bcl-2表達無顯著性差異(F=2.018,P=0.1440.05);四組大鼠海馬Beclin-1/Bcl-2表達無顯著性差異(F=0.249,P=0.8610.05)。(6)四組大鼠大腦皮層組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ有顯著性差異(F=3.704,P=0.0290.05),兩兩比較,RS+ND組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達較NS+ND組明顯降低(P0.05),RS+KD組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達較RS+ND組明顯升高(P0.05);四組大鼠海馬組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達有顯著性差異(F=3.692,P=0.0290.05),兩兩比較,RS+ND組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達較NS+ND組明顯降低(P0.05),RS+KD組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達較RS+ND組明顯升高(P0.05)。(7)四組大鼠大腦皮層p62表達有顯著性差異(F=5.498,P=0.0060.05),兩兩比較,RS+ND組p62表達較NS+ND組明顯升高(P0.05),RS+KD組p62表達較RS+ND組明顯降低(P0.05);四組大鼠海馬中p62表達有顯著性差異(F=5.095,P=0.0090.05),兩兩比較,RS+ND組p62表達較NS+ND組明顯升高(P0.05),RS+KD組p62表達較RS+ND組明顯降低(P0.05)。(8)四組大鼠大腦皮層c PLA2表達無顯著性差異(F=0.875,P=0.4710.05);四組大鼠海馬c PLA2表達有顯著性差異(F=4.365,P=0.0160.05),兩兩比較,RS+ND組c PLA2表達較NS+ND組明顯降低(P0.05),RS+KD組c PLA2表達較RS+ND組明顯升高(P0.05)。結(jié)論:1.三氟乙醚誘導(dǎo)的新生期大鼠反復(fù)驚厥發(fā)作可對大鼠生長發(fā)育、神經(jīng)行為及認(rèn)知功能造成損害,生酮飲食長期干預(yù)能夠顯著改善神經(jīng)行為及認(rèn)知功能損傷。2.驚厥后采用生酮飲食干預(yù)能夠抑制新生期大鼠反復(fù)驚厥發(fā)作所致海馬CA3區(qū)及齒狀回苔蘚纖維異常發(fā)芽。3.三氟乙醚誘導(dǎo)的新生期反復(fù)驚厥后遠期海馬及皮層組織中存在自噬相關(guān)分子Cathepsin E、Beclin-1(海馬)和p62上調(diào),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下調(diào),以及抗凋亡分子CLU上調(diào)和細胞內(nèi)磷脂酶A2(c PLA2)表達下調(diào)(海馬)。生酮飲食對上述異常表達分子具有顯著調(diào)節(jié)作用。4.研究提示,新生期驚厥性腦損傷遠期海馬及皮層中存在自噬及脂代謝相關(guān)分子表達的變化。生酮飲食的神經(jīng)保護作用可能與調(diào)節(jié)上述兩種信號通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：生酮飲食 新生期驚厥 自噬 Beclin-1 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62 cPLA2
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 引言12-15
• 第一部分 新生期反復(fù)驚厥對大鼠遠期神經(jīng)行為及認(rèn)知能力的影響以及生酮飲食的干預(yù)作用15-31
• 材料與方法15-19
• 結(jié)果19-30
• 小結(jié)30-31
• 第二部分Neo-Timm’s染色法觀察海馬苔蘚纖維發(fā)芽31-34
• 材料與方法31-33
• 結(jié)果33-34
• 第三部分CathepsinE、CLU、Beclin-1、Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 及cPLA2在四組大鼠海馬和皮層的表達情況34-49
• 材料與方法34-39
• 結(jié)果39-48
• 小結(jié)48-49
• 討論49-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-63
• 附圖63-65
• 綜述65-76
• 參考文獻72-76
• 中英文對照縮略詞表76-77
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文77-78
• 本課題資助項目78-79
• 致謝79-80

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本文編號：570710