本文關(guān)鍵詞：超低頻經(jīng)顱磁刺激對局部腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)齒狀回內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移與分化的影響

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【摘要】：[背景]隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人口結(jié)構(gòu)老年化,腦血管病已經(jīng)成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病,其中缺血性腦卒中約占腦血管病75%。腦卒中患者常存在不同程度的肢體運(yùn)動功能受損、失語、認(rèn)知精神障礙等,直接影響患者生活質(zhì)量和康復(fù)治療效果,給家庭和社會帶來巨大的傷害和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)損傷后難以再生,神經(jīng)功能的缺失是永久的,不能恢復(fù)。近年來的研究證實(shí),成年嚙齒類動物腦組織的側(cè)腦室下區(qū)及海馬區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞,在受到缺血缺氧、外傷、癲癇、生長因子等因素刺激下,可持續(xù)活化,發(fā)生增殖、遷移及分化,對受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)和神經(jīng)功能重建中發(fā)揮作用,為腦卒中等腦血管疾病的治療提供了新的突破口。然而,許多研究揭示腦缺血后雖然可引起海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生,但內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量不足,而且某些調(diào)節(jié)遷移、分化、存活、神經(jīng)元修復(fù)和突觸形成的因子也不足。因此,進(jìn)一步研究并利用生物化學(xué)及物理因素等方法來擴(kuò)大內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生,促進(jìn)其增殖,并向缺血壞死灶遷移,促進(jìn)其分化成為神經(jīng)細(xì)胞,對修復(fù)腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò),提高大腦的可塑性,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要的研究意義。經(jīng)顱磁刺激(Transcranial Magnetic Stimulation,TMS)是基于快速電磁轉(zhuǎn)換原理,利用磁場作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),使大腦皮層及皮層下神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生感應(yīng)性生物電流,影響腦內(nèi)代謝過程及神經(jīng)細(xì)胞電活動,從而引起一系列生理生化效應(yīng)的非侵入性技術(shù)。超低頻經(jīng)顱磁刺激(Infra-low-frequency transcranial magnetic stimulation, ILF-TMS)是刺激頻率0～0.2Hz之間的磁刺激。目前大多數(shù)對TMS的研究頻率均在Hz水平,針對更低刺激頻率的研究則比較少。大量的臨床及動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),ILF-TMS在治療腦損傷疾病如帕金森病、抑郁、腦血管疾病等和精神類疾病如抑郁、焦慮、失眠等取得了良好的效果。有研究證實(shí),采用ILF-TMS治療缺血性腦卒中,可明顯改善病人包括精細(xì)動作等的運(yùn)動功能、看圖識物能力、命名能力及語言表達(dá)能力。ILF-TMS可通過干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)的活性影響腦的功能,具有特殊的生物物理特性及臨床應(yīng)用價值。隨著ILF-TMS應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬,其治療機(jī)制的問題也日益受到人們的重視。目前的許多研究提示ILF-TMS治療CNS疾病可能通過影響eNSCs而發(fā)揮作用,如ILF-TMS可促進(jìn)海馬齒狀回BDNF,5-HT,DA等的表達(dá)。ILF-TMS可引起腦內(nèi)微環(huán)境的變化,而微環(huán)境則是影響eNSCs的重要因素。ILF-TMS的連續(xù)磁場可在腦區(qū)產(chǎn)生超低頻電流,進(jìn)而模擬多種神經(jīng)遞質(zhì)的慢突觸后電位的作用。施加的ILF-TMS頻率不同,可分別影響興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。我們前期的實(shí)驗(yàn)提示,對大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)損傷大鼠給予11mHz ILF-TMS治療后,通過免疫組織化學(xué)染色檢測海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)及巢蛋白(nestin)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與假刺激組比較,ILF-TMS治療組大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(endogenous Neural stem cells,eNSCs)得到持續(xù)的激活,BrdU及nestin得到更多的表達(dá),且18分制神經(jīng)功能障礙評分更高。[目的]本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步觀察ILF-TMS干預(yù)后對局部腦缺血再灌注大鼠7天、14天、21天及28天4個不同時相海馬區(qū)齒狀回顆粒下層(subgranular zone,SGZ)及顆粒細(xì)胞層(granule cell layer,GCL)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及分化的影響,并采用mNSS神經(jīng)功能障礙評分方法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評定,試圖探討ILF-TMS在缺血性腦卒中海馬齒狀回神經(jīng)損傷修復(fù)過程中的作用機(jī)制,為ILF-TMS應(yīng)用于臨床腦卒中患者的治療提供更充分的理論依據(jù)。[方法]1、參照Longa等的線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞缺血再灌注損傷模型(MCAO)。將造模成功的大鼠隨機(jī)分配到ILF-TMS7天組、ILF-TMS 14天組、ILF-TMS 21天組、ILF-TMS28天組及假刺激7天組、假刺激14天組、假刺激21天組、假刺激28天組；同時設(shè)立假手術(shù)7天組、假手術(shù)14天組、假手術(shù)21天組及假手術(shù)28天組。2、對ILF-TMS組大鼠給予刺激頻率為11mHz,場強(qiáng)均為500 Gs的超低頻經(jīng)顱磁刺激,每次30 min,1次/天；假刺激組大鼠同樣放置磁刺激儀內(nèi)固定,但不進(jìn)行超低頻經(jīng)顱磁刺激,余處理同ILF-TMS組大鼠；假手術(shù)組大鼠自然飼養(yǎng)。3、各組大鼠在處死前24小時腹腔注射Brdu,每次間隔4小時,共3次。末次注射12h后處死動物取材。4、分別在第7天、第14天、第21天及28天應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損程度評分方法(mNSS)對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評定。5、將評分后的大鼠處死后取腦,置于4%多聚甲醛中后固定過夜,之后石蠟包埋,行連續(xù)冠狀位切片。通過蘇木精-伊紅染色法(HE染色)觀察缺血組織病理形態(tài),免疫熒光染色檢測缺血后7天、14天、21天與28天4個不同時相海馬區(qū)齒狀回顆粒下層(SGZ)及顆粒細(xì)胞層(GCL)BrdU+、PSA-NCAM+、NeuN+、GFAP+表達(dá)的變化。采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖形分析,計(jì)算每平方毫米的陽性細(xì)胞數(shù)。[統(tǒng)計(jì)學(xué)方法]應(yīng)用spss 19.0版統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]1、各時間點(diǎn)假手術(shù)組大鼠活動情況較好,與ILF-TMS組大鼠及假刺激組大鼠比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第14天、21天及28天3個時間點(diǎn),ILF-TMS組較假刺激組大鼠mNSS評分降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ILF-TMS組及假刺激組大鼠mNSS評分隨時間的延長而逐漸降低,組內(nèi)任意兩時間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、病理學(xué)觀察HE染色光鏡下可見假手術(shù)組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊,組織結(jié)構(gòu)完整。局部缺血再灌注后,大鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)可見缺血灶,細(xì)胞變性壞死。海馬區(qū)細(xì)胞排列紊亂,部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清,可見核固縮,核仁消失。ILF-TMS組大鼠腦組織上述病理改變較假刺激組減輕,細(xì)胞存活數(shù)量較假手術(shù)組多,神經(jīng)細(xì)胞排列基本規(guī)整。存活細(xì)胞大小及形態(tài)基本正常,核仁清晰,胞漿藍(lán)染。3、海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)表達(dá)的變化：各組大鼠海馬齒狀回均有BrdU+細(xì)胞分布。在7天、14天、21天、28天4個時間點(diǎn),局部缺血再灌注大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組(均P0.05)。而在局部缺血再灌注后同一時相,ILF-TMS組大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)均高于假刺激組(均P0.05)。4、海馬齒狀回BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞表達(dá)的變化：假手術(shù)組海馬齒狀回僅能觀察到少量BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞。同一時間點(diǎn),局部缺血再灌注大鼠BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組(均P0.05)。而在局部缺血再灌注14天后,ILF-TMS組大鼠海馬齒狀回BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞數(shù)高于假刺激組(均P0.05)。5、海馬齒狀回BrdU+/NeuN+細(xì)胞表達(dá)的變化：假手術(shù)組海馬齒狀回僅能觀察到少量BrdU+/NeuN+細(xì)胞。在第7天后,局部缺血再灌注大鼠BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組(P0.05)。在SGZ區(qū),不同時間點(diǎn)ILF-TMS組BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)與假刺激組比較無顯著差異(均P0.05)。在GCL區(qū),21天及28天ILF-TMS組BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)較假刺激組顯著增多(P0.05)。6、海馬齒狀回BrdU+/GFAP+細(xì)胞表達(dá)的變化：假手術(shù)組海馬齒狀回僅能觀察到少量BrdU+/GFAP+細(xì)胞。在14天后,局部缺血再灌注大鼠BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組(均P0.05)。在SGZ區(qū),14天后,假刺激組BrdU+/GFAP+胞數(shù)較ILF-TMS組增多(P0.05)。在GCL區(qū),21天及28天假刺激組BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)較ILF-TMS顯著增多(P0.05)。[結(jié)論]1、大腦中動脈缺血再灌注損傷可引起大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖明顯增多,增殖的干細(xì)胞可以發(fā)生遷移并分化成為神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。2、大鼠腦梗死后有一定的自我恢復(fù)能力,超低頻經(jīng)顱磁刺激治療組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分改善更明顯,其原因可能與內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生相關(guān)。3、11mHz超低頻經(jīng)顱磁刺激能促進(jìn)局部腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,由顆粒下層遷移至顆粒細(xì)胞層,并促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：超低頻經(jīng)顱磁刺激 局部腦缺血再灌注損傷 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞 海馬齒狀回 增殖 遷移 分化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 研究背景16-25
• 第一節(jié) 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展17-20
• 第二節(jié) 經(jīng)顱磁刺激的研究進(jìn)展20-25
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法25-37
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和儀器25-27
• 第二節(jié) 對象和方法27-37
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 第四章 討論47-52
• 第五章 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線57-58
• 中英文簡寫對照表58-60
• 碩士期間發(fā)表的論文及取得的成果60-61
• 致謝61-62

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本文編號：567054