本文關(guān)鍵詞：線粒體Rho蛋白1對無鎂致癇大鼠海馬神經(jīng)元的作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 癲癇 神經(jīng)元 Miro1 神經(jīng)保護(hù) 原代培養(yǎng)

【摘要】：背景與目的癲癇(epilepsy,EP)是由多種原因引起的,以反復(fù)出現(xiàn)神經(jīng)元異常放電所致的短暫性腦功能障礙為特征的一組病變。長期、反復(fù)發(fā)作的癲癇嚴(yán)重影響著患者的生活和工作,也給家庭,社會帶來了較大的負(fù)面影響。癲癇發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,使得至今尚未能了解其全部機(jī)制,因而進(jìn)一步明確癲癇的發(fā)病機(jī)理及尋求新的診治靶點(diǎn)具有重要意義。線粒體具有為細(xì)胞生理活動提供能量和調(diào)控信號傳導(dǎo)等重要作用。因此近年來成為癲癇發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。以往研究經(jīng)證實(shí)癲癇發(fā)作可使線粒體功能受損,造成大量的變性蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器堆積在細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)使損傷的線粒體膜電位降低,并發(fā)生通透性轉(zhuǎn)運(yùn),釋放凋亡相關(guān)因子,最終引起細(xì)胞凋亡,形成神經(jīng)元對癲癇損傷更加敏感的惡性循環(huán)。因此,及時(shí)清除受損線粒體和維持線粒體正常功能顯得至關(guān)重要。線粒體移動在清除受損線粒體和維持線粒體正常功能中發(fā)揮重要作用:線粒體移動可將受損線粒體逆行運(yùn)動至胞體被降解和回收,同時(shí)將正常線粒體順向運(yùn)動至神經(jīng)元的作用部位而發(fā)揮功能,以保證病理狀態(tài)下線粒體在細(xì)胞中占領(lǐng)正確的位置及分布,來應(yīng)對病理損傷。然而,關(guān)于線粒體是如何移動的機(jī)制并不明確,一些相關(guān)研究證實(shí)存在一部分與線粒體移動密切相關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)分子,如為線粒體移動提供驅(qū)動力的馬達(dá)分子Kinesin(驅(qū)動蛋白)、Dynein(動力蛋白)和Myosin(肌球蛋白);將馬達(dá)分子與線粒體相連的銜接蛋白如Miro1/2(mitochondrial Rho-GTPase 1/2)、Milton和Syntabulin。Miro蛋白是小GTPase家族中的一員,它的N端和C端各有一個(gè)GTPase結(jié)構(gòu)域,同時(shí)含有與Ca2+相結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)域,其通過C端跨膜區(qū)域與線粒體定向結(jié)合。以往研究發(fā)現(xiàn),Miro可與Milton形成復(fù)合物,然后與Kinesin肌球重鏈(KHC)連接,進(jìn)而調(diào)控線粒體沿微管的快速移動。目前,大量國內(nèi)外研究證實(shí)癲癇過程中存在線粒體功能及結(jié)構(gòu)損傷。但線粒體移動異常在癲癇神經(jīng)元線粒體功能結(jié)構(gòu)受損中發(fā)揮何種作用;能否通過調(diào)控線粒體移動而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用仍然未知。因此,本課題在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元及無鎂誘導(dǎo)建立癲癇放電模型,同時(shí)構(gòu)建腺病毒真核表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)Miro1表達(dá),通過觀察Miro1介導(dǎo)的線粒體移動對無鎂致癇的海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、神經(jīng)元損傷和凋亡的影響,探討是否通過調(diào)控線粒體移動,減少線粒體損傷,抗凋亡級聯(lián)發(fā)揮癲癇神經(jīng)保護(hù)作用,并通過檢測神經(jīng)元中Bax、caspase-3及Bcl-2表達(dá)水平的變化,初步探討其中的可能機(jī)制。材料與方法取新生24h內(nèi)Sprague-Dawley大鼠,75%酒精浸泡消毒后,斷頭取腦,分離雙側(cè)海馬組織,制成單細(xì)胞懸液,體外進(jìn)行大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。于倒置相差顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元在培養(yǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化,選取培養(yǎng)至10d的神經(jīng)元細(xì)胞,采用免疫熒光的方法進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)神經(jīng)元純度鑒定。同時(shí)構(gòu)建表達(dá)大鼠Miro1基因的重組腺病毒真核表達(dá)質(zhì)粒(r Ad-Miro1)以及不表達(dá)任何外源基因的對照腺病毒載體(r Ad),并鑒定。取培養(yǎng)至14d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(CON組)、無鎂誘導(dǎo)組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組四組,后三組按照Sombati細(xì)胞模型方法,進(jìn)行無鎂細(xì)胞外液處理3h后恢復(fù)至正常細(xì)胞培養(yǎng)液,其中無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組在無鎂細(xì)胞外液誘導(dǎo)前48h分別轉(zhuǎn)染r Ad及r Ad-Miro1進(jìn)行預(yù)處理。造模成功24h后通過MTS試劑盒分別測定各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性變化,取各組中部分細(xì)胞采用TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡情況,剩余細(xì)胞采用QT-PCR法測定Miro1 m RNA的表達(dá),Western blot法檢測Miro1、Bax、Bcl-2及Caspase 3的表達(dá)。結(jié)果1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:倒置差相顯微鏡下可觀察到剛種植于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的大鼠海馬神經(jīng)元為較小體積的單個(gè)細(xì)胞,呈圓形,飽滿,透亮,且散在分布。部分神經(jīng)元細(xì)胞在培養(yǎng)3h后開始貼壁,幾乎所有的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至24h后均貼壁生長,并且有明顯的長短不一的突起長出。培養(yǎng)至7d時(shí),典型的神經(jīng)元軸突與樹突即可被觀察到,且胞體立體感強(qiáng),細(xì)胞核呈空泡狀,但神經(jīng)元與神經(jīng)元之間尚未形成突觸,大多為單個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至10d左右大鼠海馬神經(jīng)元之間開始形成網(wǎng)狀聯(lián)系。培養(yǎng)至14 d時(shí)神經(jīng)元胞體最大,軸突、樹突清晰,細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)變得密集。培養(yǎng)至至4w時(shí),維持液中開始有大量細(xì)胞碎片出現(xiàn),細(xì)胞逐漸凋亡。2.海馬神經(jīng)元純度鑒定:取培養(yǎng)至10d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞爬片,采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示:海馬神經(jīng)元純度達(dá)93.1%。3.神經(jīng)元活性測定:MTS試劑盒測定細(xì)胞活性結(jié)果顯示,與CON組相比,無鎂誘導(dǎo)組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組三組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與無鎂誘導(dǎo)組相比,無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.病理學(xué)檢測:TUNEL法結(jié)果顯示,與對照組相比,無鎂誘導(dǎo)組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組3組中凋亡的大鼠海馬神經(jīng)元中數(shù)目增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與無鎂誘導(dǎo)組相比,無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組凋亡的大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組凋亡的大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目增多,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.QT-PCR結(jié)果:與CON組相比,無鎂誘導(dǎo)組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組三組大鼠海馬神經(jīng)元無鎂誘導(dǎo)后24h Miro1 m RNA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與無鎂誘導(dǎo)組相比,無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組,Miro1 m RNA水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組Miro1 m RNA水平升高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.Western blot結(jié)果:與CON組比較,Miro1蛋白表達(dá)量在無鎂誘導(dǎo)后3h開始升高,24h時(shí)達(dá)最高水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與CON組比較,無鎂誘導(dǎo)組、無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組和無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組三組大鼠海馬神經(jīng)元無鎂誘導(dǎo)后24h Miro1水平均顯著升高,Bcl-2表達(dá)下降,caspase-3和Bax的激活均明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與無鎂誘導(dǎo)組相比,無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組Miro1水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組Miro1水平升高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;無鎂誘導(dǎo)+r Ad-Miro1轉(zhuǎn)染組Bcl-2表達(dá)升高,Bax和caspase-3激活減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無鎂誘導(dǎo)+r Ad轉(zhuǎn)染組Bcl-2表達(dá)升高,Bax和caspase-3激活減少,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.無鎂誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元致癇后細(xì)胞內(nèi)Miro1 m RNA及Miro1蛋白的表達(dá)水平均提高,提示線粒體移動可能參與癲癇病理損傷的過程;2.Miro1蛋白介導(dǎo)的線粒體移動對癲癇發(fā)作后的大鼠海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與及時(shí)清除受損的線粒體,抑制Bax和caspase-3表達(dá),提高Bcl-2表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抑制線粒體凋亡途徑的作用有關(guān);3.調(diào)控線粒體移動可成為抗癲癇治療的新思路和方法。
【關(guān)鍵詞】：癲癇 神經(jīng)元 Miro1 神經(jīng)保護(hù) 原代培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 符號說明14-15
• 前言15-17
• 材料及方法17-35
• 結(jié)果35-39
• 討論39-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 附圖50-55
• 綜述 神經(jīng)元中的線粒體移動及其機(jī)制研究進(jìn)展55-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 個(gè)人簡歷、研究生期間撰寫的論文65-66
• 致謝66

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 翁默;海馬神經(jīng)元的集群放電活動與關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)過程的實(shí)時(shí)對應(yīng)[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2004年01期

2 ;我�；A(chǔ)部章衛(wèi)平課題組發(fā)現(xiàn)調(diào)控海馬神經(jīng)元發(fā)育的新機(jī)制[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

3 朱輝;;新生海馬神經(jīng)元的功能與成熟神經(jīng)元相同[J];國外醫(yī)學(xué)情報(bào);2003年12期

4 李林芳;張永健;吳洋;苗慶峰;胡會青;孟靜;;雙苯氟嗪對鉛致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[J];中國公共衛(wèi)生;2006年11期

5 陳志勇;王玲;潘振偉;孫麗華;張高小;潘國聘;呂延杰;楊寶峰;;三氧化二砷對海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年01期

6 秦錦標(biāo);周紅;鄭秀琴;;氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)學(xué);2007年04期

7 苗慶峰;張偉;薛健梅;陳雪彥;張永健;;Aβ_(25～35)對海馬神經(jīng)元的損傷及雙苯氟嗪的保護(hù)作用[J];中國老年學(xué)雜志;2008年22期

8 湯欣;陳益人;周松林;丁斐;;神經(jīng)再生素促大鼠海馬神經(jīng)元生長的研究[J];解剖學(xué)報(bào);2008年01期

9 吳洋;張永健;苗慶峰;薛健梅;高霄飛;;雙苯氟嗪對谷氨酸致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[J];寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

10 鄂曉;姜爽;張英鴿;;海馬神經(jīng)元之間膜性連接的初步研究[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉蓓蓓;潘昊;陳娣;謝學(xué)猛;楊光田;;外源性硫化氫對大鼠海馬神經(jīng)元氧糖缺失/恢復(fù)損傷的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會急診醫(yī)學(xué)分會第十六次全國急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

2 周敏;崔越;周靜文;黃子芮;謝遠(yuǎn)龍;;海馬神經(jīng)元鈣離子通道的研究進(jìn)展[A];2011全國老年癡呆與衰老相關(guān)疾病學(xué)術(shù)會議第三屆山東省神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師（學(xué)術(shù)）論壇論文匯編[C];2011年

3 劉衛(wèi);郭華;鄭建全;劉振偉;劉傳繢;;苯環(huán)壬酯對煙堿誘發(fā)海馬神經(jīng)元興奮性突觸后電流的抑制作用[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

4 劉衛(wèi);郭華;鄭建全;劉振偉;劉傳繢;;苯環(huán)壬酯對煙堿誘發(fā)海馬神經(jīng)元興奮性突觸后電流的抑制作用[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會論文摘要集（第二部分）[C];2002年

5 蔣霞;朱傳鳳;江雅新;孫嵐;張英鴿;;海馬神經(jīng)元的原子力顯微成像[A];全國第七屆掃描隧道顯微學(xué)學(xué)術(shù)會議（STM'7）論文集（一）[C];2002年

6 葉偉;裘燕;劉富鑫;鐘偉霞;羅建紅;;咪唑安定對小鼠海馬神經(jīng)元放電模式的影響[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

7 石素琴;蔡志平;霍東升;石巖;賈建新;;海馬神經(jīng)元的掃描電鏡觀察[A];科技創(chuàng)新與經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整——第七屆內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會優(yōu)秀論文集[C];2012年

8 蔡志平;霍東升;石素琴;李朝暉;賈建新;方剛;張明;;新生大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)[A];科技創(chuàng)新與經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整——第七屆內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會優(yōu)秀論文集[C];2012年

9 張明;蔣莉;郭藝;;大鼠海馬神經(jīng)元無血清原代培養(yǎng)及膜電位測定[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

10 胡祁生;陳靜芳;王勇;湯劍青;萬曙霞;魏勁波;;川芎嗪對海馬神經(jīng)元電活動的調(diào)制作用[A];中國生理學(xué)會第21屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;海馬神經(jīng)元損傷及保護(hù)的納米級三維構(gòu)像變化研究[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張瑋;大鼠腦缺血—再灌注損傷時(shí)SGK1信號途徑在海馬神經(jīng)元保護(hù)的機(jī)制研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張靜;氧糖剝奪后海馬神經(jīng)元中AP4M1表達(dá)變化及其對AMPA受體運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控作用[D];鄭州大學(xué);2014年

3 芮妍芳;β-淀粉樣蛋白對海馬神經(jīng)元的急性損傷及其機(jī)理研究[D];清華大學(xué);2006年

4 沈逸;白細(xì)胞介素-2對離子型谷氨酸受體功能以及培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育、突觸發(fā)生的影響[D];浙江大學(xué);2008年

5 姚健;高氣壓對海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的影響及其機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2002年

6 吳蓓;海馬神經(jīng)元中的突觸發(fā)育機(jī)制[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2006年

7 秦海宏;原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元鋅內(nèi)穩(wěn)態(tài)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 馬夫翠;17β-群勃龍對大鼠海馬神經(jīng)元的影響及其作用機(jī)制研究[D];山東師范大學(xué);2014年

9 徐建義;血管內(nèi)皮生長因子對大鼠海馬神經(jīng)元離子通道功能的調(diào)節(jié)及其機(jī)制分析[D];復(fù)旦大學(xué);2001年

10 趙以林;異氟烷對發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元電生理及興奮性神經(jīng)毒性的影響[D];華中科技大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張馥鎮(zhèn);丙泊酚及右美托咪定對體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響及機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李敏;膽紅素致大鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元毒性損害的比較研究[D];蘭州大學(xué);2015年

3 高延倫;線粒體Rho蛋白1對無鎂致癇大鼠海馬神經(jīng)元的作用及其機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2015年

4 馬寧田;枸杞多糖對海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用及對TLR4/NF-κB信號通路的影響[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

5 李明;外源性CCK-8對甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠記憶及海馬神經(jīng)元損傷的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 成偉;腦神康膠囊對高糖乏氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[D];山東大學(xué);2015年

7 盛蕾;納米氧化鈦引起海馬神經(jīng)元毒性的分子機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 劉靚靚;槲皮素對大鼠海馬神經(jīng)元的雌激素樣保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];河北北方學(xué)院;2015年

9 鄂曉;海馬神經(jīng)元之間的大分子通訊[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

10 李林芳;雙苯氟嗪對鉛致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

，

本文編號：531474