本文關(guān)鍵詞：miR-138靶向作用FAK對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG增殖、侵襲及凋亡的影響

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【摘要】：背景與目的源自神經(jīng)上皮的腫瘤統(tǒng)稱為腦膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)細(xì)胞瘤),占顱腦腫瘤的40-50%,是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。以細(xì)胞異質(zhì)性,快速增殖,血管生成,廣泛性侵襲,缺氧和壞死為主要特點(diǎn)。一直以來,外科手術(shù)、放療和化療治療作為腦膠質(zhì)瘤的主要治療方式雖然有一定的作用,但臨床療效和預(yù)后較差,因而尋找一種新的治療靶點(diǎn)和治療方式成為一種必然。小分子RNA(micro RNAs,mi RNAs)在腦膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)使其有望成為腦膠質(zhì)瘤的新的診斷標(biāo)志物,近年來大量相關(guān)研究層出不窮。mi RNA按照其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用可分為致癌mi RNA和抑癌mi RNA,研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)mi RNA的表達(dá)水平對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡有明顯效應(yīng)。FAK是一種酪氨酸激酶,在多種生物反應(yīng),包括細(xì)胞存活增殖和遷移起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,增加FAK的表達(dá)與類腫瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)FAK在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。在本研究預(yù)實驗所得結(jié)果也顯示在腦膠質(zhì)瘤組織中存在異常高表達(dá)的FAK,我們通過生物信息學(xué)軟件分析得知mi R-138與FAK的3’UTR具有特異性結(jié)合位點(diǎn),FAK可能為mi R-138的作用靶點(diǎn)。接下來我們進(jìn)行一系列的實驗?zāi)康脑谟谶M(jìn)一步分析了解mi R-138和FAK在腦膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平,探究mi R-138表達(dá)異常升高對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡的影響,初步驗證mi R-138的作用靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制。方法1.2014年8月到2015年7月近一年間,從鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院采集了20例由外科手術(shù)治療獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科鑒定為腦膠質(zhì)瘤的臨床樣本和6例來自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科腦外傷手術(shù)患者的正常腦組織。2.應(yīng)用Western blot實驗檢測組織標(biāo)本中FAK蛋白的表達(dá)量;應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測mi R-138和FAK m RNA的表達(dá)水平3.轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞。按不同的處理方式分為三組進(jìn)行轉(zhuǎn)染:a.mi R-138組:細(xì)胞中轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體復(fù)合物和mi R-138 agomir;b.NC組,細(xì)胞中轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體復(fù)合物和mi R-138 agomir negative control;c.Blank組,只加入脂質(zhì)體。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后37℃,CO2濃度5%條件培養(yǎng)。經(jīng)24h轉(zhuǎn)染后,對轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行驗證,應(yīng)用Western blot實驗檢測各組細(xì)胞中FAK蛋白的表達(dá)量;應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測各組細(xì)胞中mi R-138和FAK m RNA的表達(dá)水平。4.CCK-8實驗檢測a、b、c三組細(xì)胞的增殖能力。5.Transwell實驗檢測a、b、c三組細(xì)胞的侵襲能力。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測a、b、c三組細(xì)胞的凋亡情況。7.裸鼠移植瘤模型建立后,應(yīng)用小動物活體成像儀檢測a、b、c三組中裸鼠瘤體的生長情況。8.生物信息學(xué)分析探索mi R-138與FAK是否存在互補(bǔ)的Seedregion區(qū)域。構(gòu)建野生和突變型FAK3’UTR重組雙熒光素報告基因載體,并與mi R-138激動劑(agomir)或mi R-138 agomir negative control共轉(zhuǎn)染到U-87 MG細(xì)胞中,運(yùn)用雙熒光素報告實驗進(jìn)行驗證。9.比較下調(diào)FAK與上調(diào)mi R-138對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用效果。將FAK-si RNAs和mi R-138 agomir分別轉(zhuǎn)染到U-87 MG細(xì)胞中,比較兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響,并與空白對照組做比較。利用Westernblot檢測FAK蛋白的表達(dá)量,熒光定量PCR方法檢測各組細(xì)胞中mi R-138和FAK m RNA的表達(dá)水平。1.腦膠質(zhì)瘤組織中mi R-138的表達(dá)水平較正常腦組織明顯降低(P0.05),FAK m RNA和FAK蛋白表達(dá)水平較正常腦組織明顯升高(P0.05)。2.U-87 MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)染mi R-138 agomir和脂質(zhì)體復(fù)合物組mi R-138的表達(dá)量明顯高于空白對照組和NC組(P0.05),而FAK m RNA的表達(dá)量明顯低于空白對照組和NC組(P0.05)。Western Blotting結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-138 agomir和脂質(zhì)體復(fù)合物組FAK蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對照組和NC組(P0.05),表明U-87 MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-138 agomir上調(diào)了mi R-138的表達(dá)水平,而FAK表達(dá)水平下降。3.CCK-8實驗表明,與空白對照組和NC組吸光度值相比,轉(zhuǎn)染mi R-138agomir和脂質(zhì)體復(fù)合物組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h、72h時在450nm波長下的吸光度值均明顯下降(P0.05),表明轉(zhuǎn)染mi R-138之后,U-87 MG細(xì)胞的增殖能力顯著降低。4.小動物活體成像儀檢測裸鼠體內(nèi)移植瘤增殖情況,結(jié)果顯示,從第2周起,mi R-138組裸鼠移植瘤熒光信號較Blank組及NC組均明顯降低(P0.05),且隨時間延長,mi R-138組細(xì)胞與Blank組及NC組熒光信號差異愈加顯著(P0.05)。表明上調(diào)mi R-138的表達(dá)可抑制裸鼠移植瘤生長。5.Transwell實驗檢測三組U-87 MG細(xì)胞的侵襲能力,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染mi R-138agomir和脂質(zhì)體復(fù)合物的細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于Blank組和NC組(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mi R-138 agomir和脂質(zhì)體復(fù)合物的細(xì)胞的凋亡百分比明顯高于Blank組和NC組(P0.05)。提示上調(diào)mi R-138表達(dá)水平對U-87 MG細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。7.生物信息學(xué)檢測顯示基因FAK的3’UTR區(qū)可能是mi R-138的一個直接作用的下游靶點(diǎn)。實驗成功構(gòu)建野生型和突變型FAK 3’UTR重組雙熒光素酶報告載體。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示:mi R-138與FAK的3’UTR野生型載體共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于其他3個對照組,說明FAK是mi R-138的靶基因。8.比較下調(diào)FAK與上調(diào)mi R-138對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及FAK和mi R-138表達(dá),檢測結(jié)果顯示,下調(diào)FAK與上調(diào)mi R-138在對細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡有類似的作用,表明mi R-138對于腦膠質(zhì)瘤的抑制作用至少部分是通過調(diào)控FAK發(fā)揮作用的。結(jié)果結(jié)論1.腦膠質(zhì)瘤組織中mi R-138表達(dá)呈現(xiàn)異常下調(diào),而FAK表達(dá)則異常上調(diào)。2.上調(diào)mi R-138的表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG的增殖和侵襲能力,并能促進(jìn)其凋亡。3.mi R-138可能通過作用于FAK的3’UTR區(qū),負(fù)向調(diào)節(jié)FAK的表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)作用。
【關(guān)鍵詞】：腦膠質(zhì)瘤 miR-138 FAK 增殖 侵襲 凋亡
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 英文縮略詞表15-16
• 1 引言16-18
• 2 實驗材料18-28
• 3 實驗方法28-42
• 4 實驗結(jié)果42-54
• 5 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 綜述60-84
• 參考文獻(xiàn)76-84
• 個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果84-85
• 致謝85

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