本文關(guān)鍵詞：miR-98通過IKKε調(diào)控NF-κB通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及機制研究

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【摘要】：目的本研究以不同病理級別的膠質(zhì)瘤組織和U87、U251腦膠質(zhì)瘤細胞為實驗對象,檢測miR-98與IKKε在腦膠質(zhì)瘤組織及細胞中的表達及其相關(guān)性,進一步探討miR-98介導IKKε/NF-κB通路的調(diào)控機制及與腦膠質(zhì)瘤侵襲性生物學行為的關(guān)系,以期為膠質(zhì)瘤的防治提供新的思路。方法1.第一步通過Real-Time PCR、Western blot方法檢測53例腦膠質(zhì)瘤標本、10例正常腦組織標本及膠質(zhì)瘤細胞中的miR-98與IKKε、NF-κB p65的表達水平,初步探究分析miR-98與IKKε、NF-κB在腦膠質(zhì)瘤組織中表達的相關(guān)性。2.第二步采用熒光素酶實驗:檢測miR-98與IKKε之間的調(diào)控關(guān)系。3.第三步研究人腦膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后對膠質(zhì)瘤細胞侵襲的影響及IKKε/NF-κB表達的體外研究,并初步探討其潛在機制。a.采用miR-98 mimics轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細胞,采用Real time PCR檢測miR-98及IKKε、MMP-9 m RNA的表達,采用Western blot檢測IKKε、細胞總NF-κB p65及細胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表達;b.Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后侵襲能力的改變,劃痕實驗評價轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后細胞遷移能力的改變。4.第四步研究在腦膠質(zhì)瘤中IKKε及NF-κB p65在miR-98調(diào)控中的作用的體外研究,并進一步驗證其機制a.pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics共轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細胞,Western blot檢測IKKε、MMP-9、細胞核中NF-κB p65蛋白的表達情況。采用Real time PCR檢測IKKε、MMP-9 m RNA的表達;b.Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞侵襲能力的改變,細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞遷移能力的改變。c.pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細胞,Western blot檢測細胞核中NF-κB p65蛋白的表達情況;Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞侵襲能力的改變,細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞遷移能力的改變。結(jié)果1、腦膠質(zhì)瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表達相關(guān)性a.miR-98表達水平與腦膠質(zhì)瘤組織病理級別呈負相關(guān);IKKε、NF-κB P65表達水平與腦膠質(zhì)瘤組織病理級別呈正相關(guān)。b.miR-98與IKKε表達水平呈密切負相關(guān)(r2=0.7223,p0.05),miR-98與NF-κB P65表達水平呈密切負相關(guān)(r2=0.6337,p0.05);NF-κB P65與IKKε表達水平呈密切正相關(guān)(r2=0.6123,p0.05)2、U251、U87細胞較HEB細胞miR-98表達下降,IKKε表達增高;熒光素酶實驗顯示:轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后,IKKε-WT報告載體的熒光強度受到顯著抑制;而IKKε-MUT報告載體的熒光強度基本不變,說明IKKεm RNA的3’UTR上存在miR-98的結(jié)合位點,證實IKKε是miR-98下游靶基因。3、轉(zhuǎn)染miR-98 mimics發(fā)現(xiàn):a.上調(diào)miR-98能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力。b.上調(diào)miR-98表達能夠下調(diào)IKKε的表達水平及抑制NF-κB p65從細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)座,從而調(diào)控NF-κB通路及抑制MMP-9的表達水平,而不影響NF-κB p65在細胞中的總含量。4、轉(zhuǎn)染pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics發(fā)現(xiàn):a.上調(diào)IKKε能夠恢復因轉(zhuǎn)染miR-98 mimics而降低的腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力;b.上調(diào)IKKε能恢復NF-κB p65的轉(zhuǎn)座從而調(diào)控NF-κB通路及恢復MMP-9的表達水平。5、轉(zhuǎn)染IKKεsi RNA+miR-98 mimics與IKKεsi RNA+miR-98 inhibitor發(fā)現(xiàn):抑制IKKε表達后miR-98 mimics及miR-98 inhibitor對NF-κB p65的轉(zhuǎn)座及MMP-9的表達無差別。6、轉(zhuǎn)染pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics發(fā)現(xiàn):上調(diào)NF-κB p65能夠恢復因轉(zhuǎn)染miR-98 mimics而降低的腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力結(jié)論miR-98可以通過IKKε基因調(diào)控NF-κB通路,影響腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、遷移能力。miR-98在膠質(zhì)瘤中作為一個抑癌基因并可做為潛在治療腦膠質(zhì)瘤的分子靶點。
【關(guān)鍵詞】：miR-98 IKKε NF-κB p65 人腦膠質(zhì)瘤
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料與方法13-23
• 2.1 材料13-16
• 2.1.1 腦膠質(zhì)瘤標本來源13-14
• 2.1.2 膠質(zhì)瘤細胞系14
• 2.1.3 細胞培養(yǎng)試劑14
• 2.1.4 Real tine PCR相關(guān)試劑及材料14
• 2.1.5 Western blot相關(guān)試劑及材料14-15
• 2.1.6 細胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑及材料15
• 2.1.7 細胞遷移、侵襲相關(guān)試劑及材料15
• 2.1.8 主要儀器和設備15-16
• 2.2 實驗方法16-23
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇16
• 2.2.2 實時熒光定量-PCR檢測腦膠質(zhì)瘤組織及細胞中miR-98、IKKεm RNA等的表達水平16-18
• 2.2.3 Western blot法檢測腦膠質(zhì)瘤細胞及組織中蛋白的表達水平18-21
• 2.2.4 熒光素酶基因報告實驗21
• 2.2.5 細胞轉(zhuǎn)染21-22
• 2.2.6 劃痕法遷移實驗22
• 2.2.7 Transwell體外侵襲實驗22
• 2.2.8 統(tǒng)計學分析22-23
• 第3章 結(jié)果23-38
• 3.1 miR-98、IKKε、NF-κB p65在腦膠質(zhì)瘤中的異常表達及相關(guān)性23-28
• 3.1.1 熒光定量PCR檢測miR-98 在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平23
• 3.1.2 Western blot檢測IKKε、NF-κB p65在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平23-24
• 3.1.3 miR-98、IKKε、NF-κB p65三者間表達水平的相關(guān)性分析24-26
• 3.1.4 Real time PCR檢測miR-98、IKKε在腦膠質(zhì)瘤細胞的表達26-27
• 3.1.5 熒光素酶報告實驗結(jié)果27-28
• 3.2 miR-98 對人腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲及IKKε/NF-κB通路影響的體外研究28-32
• 3.2.1 miR-98 mimics能有效上調(diào)腦膠質(zhì)瘤細胞中miR-98 的表達28
• 3.2.2 miR-98 mimics能有效抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力28-29
• 3.2.3 miR-98 mimics能有效抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力29-30
• 3.2.4 Western blot檢測miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細胞瘤中相關(guān)蛋白的變化30-31
• 3.2.5 Real time PCR檢測miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細胞瘤中相關(guān)基因m RNA的變化31-32
• 3.3 IKKε在miR-98 調(diào)控NF-κB通路中的作用的體外研究32-37
• 3.3.1 IKKε能有效恢復因miR-98 抑制的腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力32-33
• 3.3.2 IKKε能有效恢復因miR-98 抑制的腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力33-34
• 3.3.3 Western blot檢測IKKε轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細胞瘤中相關(guān)蛋白的變化34-35
• 3.3.4 Real time PCR檢測IKKε轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細胞瘤中相關(guān)基因m RNA的變化35
• 3.3.5 Western blot 檢測抑制 IKKε表達后轉(zhuǎn)染 mi R-98 mimics/ inhibitor 對下游相關(guān)蛋白的影響35-37
• 3.4 NF-κB在miR-98 調(diào)控IKKε中作用的體外研究37-38
• 3.4.1 NF-κB p65能有效恢復因miR-98 抑制的腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、遷移能力37-38
• 第4章 討論38-42
• 第5章 結(jié)論與展望42-43
• 5.1 結(jié)論42
• 5.2 展望42-43
• 致謝43-44
• 參考文獻44-46
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明46-47
• 綜述47-54
• 參考文獻52-54

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