本文關(guān)鍵詞：miR-98通過(guò)IKKε調(diào)控NF-κB通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的本研究以不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織和U87、U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,檢測(cè)miR-98與IKKε在腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)性,進(jìn)一步探討miR-98介導(dǎo)IKKε/NF-κB通路的調(diào)控機(jī)制及與腦膠質(zhì)瘤侵襲性生物學(xué)行為的關(guān)系,以期為膠質(zhì)瘤的防治提供新的思路。方法1.第一步通過(guò)Real-Time PCR、Western blot方法檢測(cè)53例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本、10例正常腦組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的miR-98與IKKε、NF-κB p65的表達(dá)水平,初步探究分析miR-98與IKKε、NF-κB在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性。2.第二步采用熒光素酶實(shí)驗(yàn):檢測(cè)miR-98與IKKε之間的調(diào)控關(guān)系。3.第三步研究人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響及IKKε/NF-κB表達(dá)的體外研究,并初步探討其潛在機(jī)制。a.采用miR-98 mimics轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,采用Real time PCR檢測(cè)miR-98及IKKε、MMP-9 m RNA的表達(dá),采用Western blot檢測(cè)IKKε、細(xì)胞總NF-κB p65及細(xì)胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表達(dá);b.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后侵襲能力的改變,劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后細(xì)胞遷移能力的改變。4.第四步研究在腦膠質(zhì)瘤中IKKε及NF-κB p65在miR-98調(diào)控中的作用的體外研究,并進(jìn)一步驗(yàn)證其機(jī)制a.pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics共轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,Western blot檢測(cè)IKKε、MMP-9、細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。采用Real time PCR檢測(cè)IKKε、MMP-9 m RNA的表達(dá);b.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的改變,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的改變。c.pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,Western blot檢測(cè)細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的改變,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的改變。結(jié)果1、腦膠質(zhì)瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表達(dá)相關(guān)性a.miR-98表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤組織病理級(jí)別呈負(fù)相關(guān);IKKε、NF-κB P65表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤組織病理級(jí)別呈正相關(guān)。b.miR-98與IKKε表達(dá)水平呈密切負(fù)相關(guān)(r2=0.7223,p0.05),miR-98與NF-κB P65表達(dá)水平呈密切負(fù)相關(guān)(r2=0.6337,p0.05);NF-κB P65與IKKε表達(dá)水平呈密切正相關(guān)(r2=0.6123,p0.05)2、U251、U87細(xì)胞較HEB細(xì)胞miR-98表達(dá)下降,IKKε表達(dá)增高;熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示:轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后,IKKε-WT報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度受到顯著抑制;而IKKε-MUT報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度基本不變,說(shuō)明IKKεm RNA的3’UTR上存在miR-98的結(jié)合位點(diǎn),證實(shí)IKKε是miR-98下游靶基因。3、轉(zhuǎn)染miR-98 mimics發(fā)現(xiàn):a.上調(diào)miR-98能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力。b.上調(diào)miR-98表達(dá)能夠下調(diào)IKKε的表達(dá)水平及抑制NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)座,從而調(diào)控NF-κB通路及抑制MMP-9的表達(dá)水平,而不影響NF-κB p65在細(xì)胞中的總含量。4、轉(zhuǎn)染pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics發(fā)現(xiàn):a.上調(diào)IKKε能夠恢復(fù)因轉(zhuǎn)染miR-98 mimics而降低的腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力;b.上調(diào)IKKε能恢復(fù)NF-κB p65的轉(zhuǎn)座從而調(diào)控NF-κB通路及恢復(fù)MMP-9的表達(dá)水平。5、轉(zhuǎn)染IKKεsi RNA+miR-98 mimics與IKKεsi RNA+miR-98 inhibitor發(fā)現(xiàn):抑制IKKε表達(dá)后miR-98 mimics及miR-98 inhibitor對(duì)NF-κB p65的轉(zhuǎn)座及MMP-9的表達(dá)無(wú)差別。6、轉(zhuǎn)染pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics發(fā)現(xiàn):上調(diào)NF-κB p65能夠恢復(fù)因轉(zhuǎn)染miR-98 mimics而降低的腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力結(jié)論miR-98可以通過(guò)IKKε基因調(diào)控NF-κB通路,影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力。miR-98在膠質(zhì)瘤中作為一個(gè)抑癌基因并可做為潛在治療腦膠質(zhì)瘤的分子靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：miR-98 IKKε NF-κB p65 人腦膠質(zhì)瘤
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料與方法13-23
• 2.1 材料13-16
• 2.1.1 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本來(lái)源13-14
• 2.1.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系14
• 2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)試劑14
• 2.1.4 Real tine PCR相關(guān)試劑及材料14
• 2.1.5 Western blot相關(guān)試劑及材料14-15
• 2.1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑及材料15
• 2.1.7 細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)試劑及材料15
• 2.1.8 主要儀器和設(shè)備15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-23
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇16
• 2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中miR-98、IKKεm RNA等的表達(dá)水平16-18
• 2.2.3 Western blot法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織中蛋白的表達(dá)水平18-21
• 2.2.4 熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)21
• 2.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染21-22
• 2.2.6 劃痕法遷移實(shí)驗(yàn)22
• 2.2.7 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)22
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析22-23
• 第3章 結(jié)果23-38
• 3.1 miR-98、IKKε、NF-κB p65在腦膠質(zhì)瘤中的異常表達(dá)及相關(guān)性23-28
• 3.1.1 熒光定量PCR檢測(cè)miR-98 在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平23
• 3.1.2 Western blot檢測(cè)IKKε、NF-κB p65在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平23-24
• 3.1.3 miR-98、IKKε、NF-κB p65三者間表達(dá)水平的相關(guān)性分析24-26
• 3.1.4 Real time PCR檢測(cè)miR-98、IKKε在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)26-27
• 3.1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-28
• 3.2 miR-98 對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及IKKε/NF-κB通路影響的體外研究28-32
• 3.2.1 miR-98 mimics能有效上調(diào)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-98 的表達(dá)28
• 3.2.2 miR-98 mimics能有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力28-29
• 3.2.3 miR-98 mimics能有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力29-30
• 3.2.4 Western blot檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)蛋白的變化30-31
• 3.2.5 Real time PCR檢測(cè)miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)基因m RNA的變化31-32
• 3.3 IKKε在miR-98 調(diào)控NF-κB通路中的作用的體外研究32-37
• 3.3.1 IKKε能有效恢復(fù)因miR-98 抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力32-33
• 3.3.2 IKKε能有效恢復(fù)因miR-98 抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力33-34
• 3.3.3 Western blot檢測(cè)IKKε轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)蛋白的變化34-35
• 3.3.4 Real time PCR檢測(cè)IKKε轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)基因m RNA的變化35
• 3.3.5 Western blot 檢測(cè)抑制 IKKε表達(dá)后轉(zhuǎn)染 mi R-98 mimics/ inhibitor 對(duì)下游相關(guān)蛋白的影響35-37
• 3.4 NF-κB在miR-98 調(diào)控IKKε中作用的體外研究37-38
• 3.4.1 NF-κB p65能有效恢復(fù)因miR-98 抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力37-38
• 第4章 討論38-42
• 第5章 結(jié)論與展望42-43
• 5.1 結(jié)論42
• 5.2 展望42-43
• 致謝43-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明46-47
• 綜述47-54
• 參考文獻(xiàn)52-54

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本文編號(hào)：515801