本文關(guān)鍵詞：室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移的影響因素及機(jī)制研究

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【摘要】：位于側(cè)腦室壁SVZ的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSCs)具有自我更新、增殖、干性維持、遷移和分化為神經(jīng)系統(tǒng)主要神經(jīng)細(xì)胞亞群的潛能。近年來研究證實(shí)SVZ的NSCs可在腦損傷(如:腦缺血、腦出血、腦外傷)后,發(fā)生原位激活,增殖、遷移,并在損傷灶處分化為功能神經(jīng)元,整合于受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)功能。盡管研究證實(shí)了其在腦組織損傷后的功能,但腦組織受損后SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和向損傷灶遷移能力有限,影響腦損傷后的功能康復(fù)。因此,針對SVZ神經(jīng)干細(xì)胞這一特殊的細(xì)胞群體,研究增強(qiáng)其增殖和遷移能力的藥物及潛在機(jī)制具有重大的基礎(chǔ)研究和臨床意義。組織p H值是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮功能的重要微環(huán)境參數(shù),病理條件下如腦缺血后可引起大量酸性物質(zhì)的堆積,使得缺血核心區(qū)周圍組織p H可下降至6.5,嚴(yán)重時6.0以下,它的變化必然會影響SVZ神經(jīng)干細(xì)胞功能,因此我們推測微環(huán)境酸化對SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的遷移會產(chǎn)生抑制作用。同時,青蒿琥酯(Artesunate)具有高效、低毒、易通過血腦屏障的特性,在臨床中被廣泛用于瘧疾的治療,近年來研究表明其也有抗腫瘤的作用。但其對SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用未見相關(guān)研究,我們推測適當(dāng)濃度的ART可促進(jìn)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。為驗(yàn)證以上兩種推測的正確性,本研究以SVZ神經(jīng)干細(xì)胞為切入點(diǎn),結(jié)合離體和在體實(shí)驗(yàn),綜合應(yīng)用免疫熒光、激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)、藥理學(xué)、生化與分子生物學(xué)等方法,闡述ART對SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用及ASIC1a對SVZ神經(jīng)干細(xì)胞遷移的抑制作用及可能機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下:一、酸敏感離子通道1a對SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞遷移中的作用及機(jī)制研究目的通過體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞,采用免疫熒光方法檢測酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channels 1a,ASIC1a)蛋白在NSCs的表達(dá);建立不同酸化梯度環(huán)境,研究其對NSCs遷移的影響;并采用Pc TX1研究酸敏感離子通道對NSCs遷移影響的可能機(jī)制。方法通過體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞,以PO包被后,分別將神經(jīng)干細(xì)胞球(neurosp Here)置于以下各組:對照組(p H 7.4)、p H 6.0組p H 6.5組、p H 6.8組、p H 7.0組、p H 7.2組,24h后以倒置相差顯微鏡觀察各組遷出的細(xì)胞數(shù)目及遷行距離,篩選對遷移影響最明顯的p H值;以CCK8法檢測各組之間p H對神經(jīng)干細(xì)胞球活性的影響;免疫熒光法行Nestin和ASIC1a之間的雙標(biāo)、RT-PCR及WB確認(rèn)ASIC1a在NSCs上的表達(dá);設(shè)置對照組(p H7.4)、p H 6.8組、p H 6.8+Pc TX1組,分別在24h以倒置相差顯微鏡和Transwell法觀察ASIC1a對神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響,并以WB檢測各組之間ASIC1a蛋白表達(dá)水平的差異;實(shí)驗(yàn)動物以同樣的分組,在紋狀體區(qū)分別注入20μl各p H值的生理鹽水,動物造模成功后腹腔內(nèi)注射Brdu(50mg/Kg),并于3天時將動物處死,以Brdu+Nestin免疫熒光雙染,觀察SVZ向酸化灶處遷移的細(xì)胞數(shù)目和距離。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ASIC1a對神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果1.在p H 6.0和p H 6.5的酸性環(huán)境中,神經(jīng)干細(xì)胞的活性與對照組相比受到明顯影響;2.在p H 6.8的酸性環(huán)境中,神經(jīng)干細(xì)胞的活性未見明顯影響,但神經(jīng)干細(xì)胞從細(xì)胞球向外遷出的數(shù)量和距離明顯減少和縮短;3.ASIC1a+與nestin+的神經(jīng)干細(xì)胞共標(biāo),且通過RT-PCR和WB分別檢測了m RNA和蛋白的表達(dá),即:ASIC1a在NSCs上表達(dá);4.p H 6.8酸性環(huán)境中NSCs的遷移受到抑制,ASIC1a在該效應(yīng)中起重要作用;Pc TX1可減弱該現(xiàn)象;5.p H 6.8組的微環(huán)境酸化遷移模型中SVZ向酸化灶處遷移的Brdu+細(xì)胞數(shù)目明顯減少,當(dāng)應(yīng)用Pc TX1后,該現(xiàn)象減弱。結(jié)論ASIC1a在NSCs上的表達(dá);神經(jīng)干細(xì)胞在p H 6.8的酸性環(huán)境中遷移能力受到明顯抑制;ASIC1a與酸性環(huán)境中NSCs遷移能力受到抑制相關(guān),Pc TX1可減弱酸性環(huán)境中抑制NSCs遷移的現(xiàn)象。二、青蒿琥酯調(diào)控AKT促進(jìn)大鼠SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖的體外研究目的 通過體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞,采用CCK8及Ki-67免疫熒光方法檢測不同濃度青蒿琥酯對NSCs增殖的影響,并利用PI3K-AKT通路阻斷劑(LY294002)干預(yù)后,采用WB方法評估該通路在ART促進(jìn)NSCs增殖中的潛在作用和機(jī)制。方法設(shè)置不同濃度的ART分組:400 nmol/L組、800 nmol/L組、1.6μmol/L組、3.2μmol/L組,作用于體外培養(yǎng)的NSCs 24h后,利用CCK8試劑孵育2.5h后利用多功能酶標(biāo)儀在波長450nm處測定光密度值[D(450)],并于促增殖作用最明顯的ART濃度組加入10μmol/L LY294002,再次采用CCK8法檢測LY294002對NSCs增殖的影響。設(shè)置如下4組:Ctrl(DMSO)、LY294002組、800 nmol/L ART組、800 nmol/L ART+LY294002組,待細(xì)胞培養(yǎng)24h后,采用Ki-67免疫熒光雙標(biāo)研究PI3K-AKT通路在其中的作用,同時采用WB方法檢測各組Nestin、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果1.CCK8檢測結(jié)果顯示在450nm處光密度值800 nmol/L ART組較空白對照組明顯升高(P0.05),在加入10μmol/L LY294002后,其光密度值明顯下降,與空白對照組水平相當(dāng);2.Ki-67免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:800 nmol/L ART可明顯促進(jìn)NSCs增殖,10μmol/L LY294002可抑制這一作用;3.WB結(jié)果顯示:Nestin及p-AKT蛋白表達(dá)水平在800 nmol/L ART組明顯上調(diào),在加入10μmol/L LY294002后兩者表達(dá)水平均下調(diào)(P0.05)。結(jié)論800 nmol/L ART在體外可促進(jìn)SVZ分離培養(yǎng)的NSCs的增殖,其機(jī)制與PI3K-AKT信號通路相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細(xì)胞 酸敏感離子通道1a SVZ 遷移 PcTX1 神經(jīng)干細(xì)胞 青蒿琥酯 PI3K-AKT 信號通路 SVZ
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 酸敏感離子通道 1a在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移中的作用及機(jī)制研究15-34
• 2.1 材料與方法16-25
• 2.2 結(jié)果25-29
• 2.3 討論29-32
• 2.4 小結(jié)32-34
• 第三章 青蒿琥酯調(diào)控AKT促進(jìn)大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的體外研究34-47
• 3.1 材料與方法35-40
• 3.2 結(jié)果40-43
• 3.3 討論43-46
• 3.4 小結(jié)46-47
• 全文總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 文獻(xiàn)綜述54-76
• 參考文獻(xiàn)67-76
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表和待發(fā)表的論文76-77
• 致謝77

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Proton production,regulation and pathophysiological roles in the mammalian brain[J];Neuroscience Bulletin;2012年01期

  本文關(guān)鍵詞：室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移的影響因素及機(jī)制研究

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本文編號：513827