本文關(guān)鍵詞：大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬新生顆粒細(xì)胞樹(shù)突的發(fā)育特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的哺乳類(lèi)動(dòng)物海馬齒狀回是終生具有產(chǎn)生顆粒細(xì)胞能力的腦結(jié)構(gòu)。位于齒狀回顆粒下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞在受到刺激后分化、發(fā)育為成熟顆粒細(xì)胞,同時(shí)整合至齒狀回神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。嚙齒類(lèi)動(dòng)物成年新生顆粒細(xì)胞在新生后在經(jīng)歷不同發(fā)育階段后,約需2個(gè)月成為與已經(jīng)存在顆粒細(xì)胞在形態(tài)、電生理學(xué)性質(zhì)和突觸聯(lián)系相似的成熟顆粒細(xì)胞。成年顆粒細(xì)胞新生與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)、記憶形成以及情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)。許多生理、病理因素可以顯著改變成年海馬齒狀回神經(jīng)新生。癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回神經(jīng)新生出現(xiàn)短暫增強(qiáng)。迄今,在癲癇發(fā)生中神經(jīng)新生增強(qiáng)的意義尚存爭(zhēng)議。借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)基因?qū)π律w粒細(xì)胞的標(biāo)識(shí)以及共聚焦成像,本課題研究了匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中樹(shù)突形態(tài)、樹(shù)突棘密度和細(xì)胞活性的變化。材料和方法材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性SD大鼠(140-170 g,6-7周齡)。方法：1.癲癇持續(xù)狀態(tài)的誘導(dǎo)以及齒狀回內(nèi)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)以腹腔內(nèi)注射匹羅卡品誘導(dǎo)。選取對(duì)Racine氏SE分級(jí)Ⅱ級(jí)或以上、發(fā)作時(shí)間長(zhǎng)于2小時(shí)的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以腹腔內(nèi)生理鹽水注射的同齡動(dòng)物作為對(duì)照。CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在SE誘導(dǎo)第5天以立體定向技術(shù)注入海馬齒狀回。2.灌流和切片制作在CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體齒狀回內(nèi)注射5天、28天或至少70天后,腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物后,用4%多聚甲醛經(jīng)心臟對(duì)腦進(jìn)行灌流固定。取腦后,以4%多聚甲醛對(duì)腦進(jìn)行后固定過(guò)夜。在以10%-15%-20%蔗糖磷酸緩沖液對(duì)樣本進(jìn)行沉糖處理后,以明膠-白蛋白-戊二醛混合液包埋組織塊,經(jīng)振動(dòng)切片機(jī)制作厚度為100μm或40μm的海馬冠狀切片。3.免疫熒光染色GFP免疫熒光染色：在普通熒光顯微鏡下,挑選出含有GFP細(xì)胞的100μm厚切片。對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色,所用一抗和二抗分別山羊抗GFP以及和Alexa fluor 488結(jié)合的驢抗山羊IgG。Arc免疫熒光染色：在普通熒光顯微鏡下,挑選出含有GFP細(xì)胞的40μm厚切片。對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色,所用一抗和二抗分別為兔抗Arc以及和Alexa fluor568結(jié)合的驢抗兔IgG。NeuN免疫熒光染色：在普通熒光顯微鏡下,挑選出含有GFP陽(yáng)性細(xì)胞(GFP+)的40μm厚切片。對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色,所用一抗和二抗分別為鼠抗NeuN以及和Alexa fluor568結(jié)合的驢抗鼠IgG。4.樹(shù)突復(fù)雜性分析對(duì)分布于齒狀回上支、少與其它細(xì)胞重疊、樹(shù)突分支基本完整的細(xì)胞進(jìn)行z軸連續(xù)序列掃描,以此獲取神經(jīng)元胞體以及樹(shù)突的3D圖片。應(yīng)用ZEN軟件對(duì)該3D圖片進(jìn)行z軸最大密度投影。在Image J中打開(kāi)投影后細(xì)胞圖像,手動(dòng)描繪出細(xì)胞胞體和樹(shù)突。樹(shù)突復(fù)雜程度以Sholl法進(jìn)行分析：以神經(jīng)元胞體中心為圓心,每隔25μm劃一同心圓。樹(shù)突與同心圓交點(diǎn)的數(shù)目代表樹(shù)突復(fù)雜性。5.樹(shù)突棘密度分析對(duì)于位于齒狀回上支的每一個(gè)GFP+顆粒細(xì)胞,隨機(jī)選取中段和末段樹(shù)突各3段進(jìn)行高倍鏡下的z軸系列掃描,建立各段樹(shù)突的3D圖像,在Image J中對(duì)樹(shù)突棘進(jìn)行計(jì)數(shù)。樹(shù)突棘密度以樹(shù)突棘數(shù)目除以樹(shù)突長(zhǎng)度計(jì)算。6.Arc熒光強(qiáng)度分析共聚焦拍攝GFP陽(yáng)性以及周?chē)鶪FP陰性細(xì)胞(GFP-)Arc熒光圖像后,應(yīng)用Image J軟件對(duì)GFP陽(yáng)性顆粒細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。隨機(jī)選取同張照片外分子層的10個(gè)顆粒細(xì)胞,測(cè)其Arc熒光強(qiáng)度,計(jì)算這些GFP陰性細(xì)胞的平均Arc熒光強(qiáng)度。GFP+神經(jīng)元的活動(dòng)水平以GFP+神經(jīng)元的Arc熒光強(qiáng)度值與GFP-細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度均值的比值來(lái)表示。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)定量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以Grahpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。P≤0.05,考慮為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：1.正常生理?xiàng)l件下和癲癇病理?xiàng)l件下,大鼠海馬齒狀回均有成年后神經(jīng)新生現(xiàn)象,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的GFP標(biāo)識(shí)方法標(biāo)記的細(xì)胞類(lèi)型有顆粒細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。GFP+顆粒細(xì)胞分布于顆粒細(xì)胞層內(nèi)1/3,GFP在胞體、軸突、樹(shù)突均有表達(dá)。2. 與對(duì)照組同齡顆粒細(xì)胞相比,癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞在未成熟階段(4周齡)樹(shù)突復(fù)雜度更高,而在成熟后(10周齡),樹(shù)突復(fù)雜度沒(méi)有差異。3. 與對(duì)照組同齡顆粒細(xì)胞相比,癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞在未成熟階段(4周齡)位于中分子層的樹(shù)突棘密度(對(duì)照組：1.96±0.05個(gè)/μm,n=5；癲癇組：2.23±0.04個(gè)/μm,n=4)和蘑菇狀樹(shù)突棘密度(對(duì)照組：0.06±0.002個(gè)/μm,n=5；癲癇組：0.07±0.002個(gè)/μm,n=4)更高。而癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞成熟后(10周齡)與對(duì)照組同齡顆粒細(xì)胞相比,位于外分子層的蘑菇狀樹(shù)突棘密度(對(duì)照組：0.10±0.007個(gè)/μm,n=6；vr癇組：0.13±0.01個(gè)/gm,n=6)更高。4.對(duì)照組和癲癇組未成熟GFP+細(xì)胞(4周齡)Arc的熒光強(qiáng)度與周?chē)墒霨FP-顆粒細(xì)胞Arc的熒光強(qiáng)度平均值的比值分別為(1.54±0.13,n=3)和(1.45±0.17,n=7),活動(dòng)水平高于周?chē)墒祛w粒細(xì)胞。對(duì)照組和癲癇組成熟GFP+細(xì)胞(10周齡)Arc的熒光強(qiáng)度與周?chē)殉墒霨FP顆粒細(xì)胞Arc的熒光強(qiáng)度平均值的比值分別為(1.18±0.10,n=6)和(0.98±0.04,n=6),活動(dòng)水平與周?chē)墒祛w粒細(xì)胞相近。結(jié)論：與自然狀態(tài)下新生的顆粒細(xì)胞相比,癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)樹(shù)突和細(xì)胞活動(dòng)度的發(fā)育性改變。癲癇持續(xù)狀態(tài)后4周齡新生顆粒細(xì)胞的樹(shù)突分支較自然狀態(tài)下新生同齡顆粒細(xì)胞復(fù)雜,細(xì)胞活動(dòng)度顯著高于已存在顆粒細(xì)胞,提示細(xì)胞的高興奮性。癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞成熟后的樹(shù)突復(fù)雜度、中段樹(shù)突棘密度與自然狀態(tài)下同齡顆粒細(xì)胞相似,而細(xì)胞活動(dòng)度低于已存在顆粒細(xì)胞。這一結(jié)果提示：癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞對(duì)齒狀回高興奮性的影響是短暫而非持久的。
【關(guān)鍵詞】：癲癇持續(xù)狀態(tài) 齒狀回 神經(jīng)新生 顆粒細(xì)胞 樹(shù)突 樹(shù)突棘 活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R742.1
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符號(hào)說(shuō)明14-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-21
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-24
• 討論24-26
• 結(jié)論26-27
• 附圖27-33
• 參考文獻(xiàn)33-43
• 致謝43-44
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄44-45
• 文獻(xiàn)綜述45-64
• 參考文獻(xiàn)53-64
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表64

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