發(fā)布時(shí)間：2017-06-29 09:15

  本文關(guān)鍵詞：馬索羅酚對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障的影響及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:應(yīng)用多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)國際上公認(rèn)的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)小鼠,研究馬索羅酚(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)對(duì)EAE小鼠血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的影響及相關(guān)機(jī)制,旨在觀察NDGA對(duì)EAE小鼠的治療作用并探究該藥物對(duì)于EAE小鼠BBB潛在的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制,從而為今后臨床應(yīng)用馬索羅酚輔助治療MS等中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供新的理論依據(jù),尋找臨床治療MS的新靶點(diǎn)。方法:將66只8-10周雌性近交系C57BL/6小鼠(體重為18-20g),隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組、EAE組、馬索羅酚組,其中每組各為22只。各組又分為發(fā)病前給藥組與發(fā)病后給藥組兩個(gè)亞組。其中發(fā)病前給藥組又分為免疫后第8天組、免疫后第14天組兩個(gè)亞組,各亞組2只。發(fā)病后給藥組分為給藥第10天組、給藥第20天組兩個(gè)亞組,其中給藥后第10天組6只,給藥后第20天組12只。免疫小鼠時(shí)應(yīng)用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成為5mg/ml后,將完全弗氏佐劑(結(jié)核桿菌的終濃度為4mg/ml)按同等體積加入,混合均勻,充分乳化,將小鼠用乙醚麻醉后,固定小鼠,在小鼠脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)進(jìn)行皮下注射,每個(gè)點(diǎn)注射0.025ml,總共0.1ml。于免疫當(dāng)天的第0h及第48h分兩次給每只小鼠腹腔注射500ng PTX(1000ng/只)�？瞻讓�(duì)照組不予免疫。將免疫當(dāng)天記為第0天,發(fā)病前給藥組自免疫第0天開始給予藥物干預(yù),給予NDGA組每只小鼠NDGA 10mg/kg每日腹腔注射;給予EAE組及正常對(duì)照組小鼠5%DMSO10 ml/kg每日腹腔注射。發(fā)病后給藥組待每組動(dòng)物發(fā)病達(dá)1分(15分法)后開始給予NDGA組的每只小鼠NDGA 10mg/kg每日腹腔注射;給予EAE組及正常對(duì)照組的小鼠5%DMSO 10 ml/kg每日腹腔注射。于動(dòng)物免疫當(dāng)日及免疫后每日上午8:00與下午17:00對(duì)動(dòng)物體重、活動(dòng)狀況、精神狀態(tài)以及皮毛光澤度進(jìn)行觀察,并采用國際通用的15分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。各組小鼠于不同時(shí)間點(diǎn)取材后應(yīng)用熒光顯微鏡法觀察伊文斯蘭染色后血腦屏障通透性的改變,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠脊髓組織中claudin-5、ZO-1、occludin、MMP-9的表達(dá)情況,應(yīng)用confocal法檢測小鼠腦組織中緊密連接蛋白claudin-5、ZO-1、occludin的表達(dá)與定位情況。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測小鼠脊髓組織中MMP-9、NF-κB m RNA水平的改變情況。結(jié)果:1神經(jīng)功能評(píng)分正常對(duì)照組小鼠均未發(fā)病。分別比較給藥第10天與給藥第20天EAE組與NDGA組中小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分均數(shù)。在不同時(shí)間點(diǎn)NDGA組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分低于EAE組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2伊文斯蘭染色結(jié)果發(fā)病前給藥組:給藥第8天EAE組及NDGA組脊髓組織中可見少許的紅色熒光分布于脊膜下,給藥第14天EAE組可見大量的紅色熒光分布于脊膜下,NDGA組的紅色熒光與EAE組相比較分布于脊膜下的較少。而對(duì)照組小鼠脊膜下未見明顯的熒光分布。發(fā)病后給藥組:給藥10天組中EAE組小鼠脊髓組織中脊膜下的熒光成斑片狀分布,且熒光強(qiáng)度高,NDGA組與EAE組相比較,熒光范圍較小且強(qiáng)度較弱。給藥后第20天,NDGA組與EAE組伊文斯蘭無論從滲出的量還是從熒光強(qiáng)度上與給藥后第10天組相比較均有不同程度的減少,而NDGA組較EAE組減少得更加明顯。3各組小鼠緊密連接蛋白的表達(dá)情況3.1 claudin-5表達(dá)情況3.1.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中claudin-5的表達(dá)情況:EAE組小鼠脊髓組織中claudin-5較正常對(duì)照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,NDGA組較EAE組表達(dá)明顯增多。3.1.2 confocal法檢測給藥后第20d各組小鼠腦組織中claudin-5的表達(dá)情況:正常對(duì)照組claudin-5陽性細(xì)胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中,EAE組與NDGA組claudin-5的連續(xù)性遭到破壞,且排列紊亂,但NDGA組較EAE組連續(xù)性破壞較輕。3.2 occludin的表達(dá)情況3.2.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中occludin的表達(dá)情況:EAE組小鼠脊髓組織中occludin較正常對(duì)照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,NDGA組較EAE組表達(dá)明顯增多。3.2.2 confocal法檢測給藥后第20d各組小鼠腦組織中occludin的表達(dá)情況:正常對(duì)照組occludin陽性細(xì)胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中,EAE組與NDGA組occludin的連續(xù)性遭到破壞,且排列紊亂,但NDGA組較EAE組緊密連接蛋白的連續(xù)性破壞較輕。3.3 ZO-1的表達(dá)情況3.3.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中ZO-1的表達(dá)情況:EAE組小鼠脊髓組織中ZO-1較正常對(duì)照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,NDGA組較EAE組表達(dá)明顯增多。3.3.2 confocal法檢測給藥后第20天各組小鼠腦組織中ZO-1的表達(dá)情況正常對(duì)照組occludin陽性細(xì)胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中,EAE組與NDGA組occludin的連續(xù)性遭到破壞,且排列紊亂,但NDGA組較EAE組緊密連接蛋白的連續(xù)性破壞較輕。4各組小鼠MMP-9的表達(dá)情況4.1.免疫組化結(jié)果顯示:在給藥后第20天對(duì)照組的脊髓組織中均未見明顯的MMP-9陽性細(xì)胞。EAE組與NDGA組的小鼠脊髓組織均可見MMP-9在脊膜細(xì)胞和小血管內(nèi)皮細(xì)胞還有少量在膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)。NDGA組與EAE組相比較,MMP-9陽性細(xì)胞中棕黃色顆粒染色較淺,數(shù)目較少。4.2 RT-PCR檢測給藥后第10天、第20天脊髓組織中MMP-9 m RNA水平:與正常對(duì)照組相比較,EAE組與NDGA組各個(gè)時(shí)間的小鼠的MMP-9m RNA水平均有上調(diào),其中NDGA組較EAE組表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5各組小鼠NF-κB的表達(dá)情況RT-PCR檢測給藥后第10天、第20天脊髓組織中NF-κB m RNA水平:與正常對(duì)照組相比較,EAE組與NDGA組小鼠的NF-κB m RNA水平均有上調(diào),NDGA組較EAE組表達(dá)水平減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1 EAE小鼠發(fā)病前期即存在血腦屏障的破壞,且病情越嚴(yán)重,其破壞程度越明顯。2馬索羅酚可以減輕EAE小鼠疾病進(jìn)展,保護(hù)血腦屏障免遭破壞,其機(jī)制可能是通過保護(hù)緊密連接蛋白完整性以及抑制MMP-9、NF-κB的表達(dá)而發(fā)揮作用的。
【關(guān)鍵詞】：實(shí)驗(yàn)性自身性免疫性腦脊髓炎 多發(fā)性硬化 馬索羅酚 血腦屏障 緊密連接蛋白
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R744.5
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-25
• 附圖25-31
• 附表31-32
• 討論32-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 綜述 多發(fā)性硬化與血腦屏障39-51
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 致謝51-52
• 個(gè)人簡歷52

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1 肖瑩瑩;張藝;張靜;鄧

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