本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)4.1R與重癥肌無力關(guān)系的探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景重癥肌無力(Myasthenia gravis,MG)是神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID),也是目前抗原最為明確的AID。迄今為止發(fā)病機(jī)制還不明了,缺乏特效的治療方案,目前多以口服藥物、免疫抑制劑注射及胸腺切除術(shù)等治療手段較常見。課題組前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從重癥肌無力(MG)伴胸腺異常的病人胸腺組織中篩選出差異蛋白4.1R。4.1R(EPB41)是蛋白質(zhì)4.1家族的成員之一,它是細(xì)胞骨架蛋白,在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有表達(dá)。它參與細(xì)胞增殖分裂的調(diào)控,且其表達(dá)異常會影響細(xì)胞的極性及細(xì)胞的遷移等。它與其他細(xì)胞膜骨架蛋白,肌肉收縮相關(guān)蛋白等均有相互作用,可引起如貧血、肌肉收縮障礙等疾病。同時與離子交換蛋白及細(xì)胞膜鈣泵蛋白等相互作用,可以調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及鈣離子的吸收等功能。蛋白質(zhì)4.1R在多種腫瘤疾病中都有研究,且發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)4.1R是腫瘤的負(fù)調(diào)控分子。蛋白質(zhì)4.1R對T細(xì)胞的活化有負(fù)調(diào)控作用,而T細(xì)胞的活化異常可導(dǎo)致AID的發(fā)生。與很多疾病的發(fā)生都相關(guān),但目前4.1R在AID中的研究較少,在MG中的研究更少。本課題主要以重癥肌無力兩個典型的臨床癥狀“自身免疫”和“肌無力”為主線,探討蛋白4.1R在MG中的作用機(jī)制。將對MG的發(fā)病機(jī)制和MG的治療提供更進(jìn)一步的認(rèn)識和幫助。目的以“自身免疫”為主線利用4.1R對DC細(xì)胞的生物功能影響來探討蛋白質(zhì)4.1R在重癥肌無力中的作用機(jī)制。另外以“肌無力”為主線利用4.1R在膈肌無力模型中的表達(dá)及意義來反映蛋白質(zhì)4.1R在MG中的作用機(jī)制。方法將基因4.1R的CDS區(qū)全長片段與pCMV-C-Flag和pEGFP-N2載體重組,構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒4.1R-Flag和4.1R-GFP,然后將它們轉(zhuǎn)到DC細(xì)胞中,加G418篩選,得到穩(wěn)定株DC-Flag、DC-4.1R-Flag(DC-4.1R-Flag)、DC-GFP、DC-4.1R-GFP(DC-4.1R-Flag);將空病毒RNAi-Control及經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染包裝的sh-4.1R轉(zhuǎn)入DC細(xì)胞,篩選得到空病毒的穩(wěn)定株iidc-rnai-control(對照nc)和dc-4.1r-rnai(dc-sh-4.1r)。用rt-pcr和wb方法驗(yàn)證dc-4.1r-flag、dc-4.1r-gfp、dc-sh-4.1r在mrna及蛋白水平的表達(dá)。然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測dc-4.1r-flag、dc-sh-4.1r及其相應(yīng)對照組穩(wěn)定株的表面分子mhcii及共刺激分子cd80、cd86的表達(dá)。用細(xì)胞劃痕和transwell小室實(shí)驗(yàn)來研究基因4.1r過表達(dá)與沉默后dc細(xì)胞遷移的改變。然后,用rt-pcr和免疫印跡雜交方法及免疫組化方法檢測4.1r在感染致膈肌無力模型中的變化。用免疫印跡雜交方法和細(xì)胞免疫組化方法驗(yàn)證4.1r基因敲低后c2c12細(xì)胞中肌肉型乙酰膽堿受體的變化。結(jié)果1、成功構(gòu)建4.1r-flag及4.1r-egfp過表達(dá)質(zhì)粒。2、成功篩選得到過表達(dá)穩(wěn)定株dc-flag(對照組)、dc-4.1r-flag、dc-egfp(對照組)、dc-4.1r-egfp;沉默穩(wěn)定株dc-rnai-control(對照組nc)和dc-sh-4.1r穩(wěn)定株。3、dc-4.1r-flag穩(wěn)定株與對照組相比體積變大,突觸減少;dc-sh-4.1r穩(wěn)定株與對照組相比體積變小,突觸變的較細(xì)且多。4、經(jīng)流式檢測,dc-4.1r-flag穩(wěn)定株與對照組相比表面分子mhcii和共刺激分子cd80、cd86的表達(dá)量降低(p0.05);而dc-sh-4.1r穩(wěn)定株與對照組相比表面共刺激分子cd80、cd86的表達(dá)量升高(p0.05),但表面分子mhcii變化不明顯。5、經(jīng)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞劃痕和transwell小室實(shí)驗(yàn))發(fā)現(xiàn)dc-4.1r-flag穩(wěn)定株與對照組相比遷移能力變強(qiáng)(p0.05),而dc-sh-4.1r穩(wěn)定株與對照組相比遷移能力下降(p0.05)。6、用rt-pcr及wb、免疫組化實(shí)驗(yàn)證明4.1r在膈肌無力模型中mrna水平及蛋白水平表達(dá)量與其對照組相比均增高。7、通過在感染致膈肌無力模型及c2c12細(xì)胞中檢測蛋白質(zhì)4.1r及各肌肉收縮蛋白發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)4.1r可以調(diào)節(jié)肌間、肌球蛋白的變化。8、經(jīng)wb與細(xì)胞免疫組化驗(yàn)證在c2c12細(xì)胞中沉默基因4.1r發(fā)現(xiàn)肌肉型achr的陽性顆粒比對照組多且著色深,兩者存在負(fù)相關(guān)性。結(jié)論1、4.1r可以影響dc細(xì)胞的形態(tài)、抗原遞呈能力及遷移能力。2、4.1R與肌無力發(fā)生相關(guān),與乙酰膽堿受體在肌肉細(xì)胞中的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。所以無論從自身免疫還是肌無力角度來探討,4.1R都參與了MG的發(fā)生,是MG的重要分子。
【關(guān)鍵詞】：4.1R 重癥肌無力 DC細(xì)胞 膈肌無力 乙酰膽堿受體
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R746.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 縮略詞表13-15
• 引言15-17
• 第一部分 探討 4.1R對DC細(xì)胞生物功能的影響17-45
• 1.1 前言17
• 1.2 材料17-23
• 1.2.1 主要試劑17-19
• 1.2.2 儀器設(shè)備19-20
• 1.2.3 主要溶劑的配制20-23
• 1.3 方法23-32
• 1.3.1 引物設(shè)計(jì)23
• 1.3.2 基因 4.1R過表達(dá)載體的構(gòu)建23-27
• 1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染27
• 1.3.5 mRNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)27-28
• 1.3.6 熒光定量PCR28-29
• 1.3.7 蛋白質(zhì)的提取和BCA法測定蛋白濃度29
• 1.3.8 免疫印跡雜交法29-31
• 1.3.9 細(xì)胞膜表面表達(dá)分子及表面共刺激的分子的檢測（直接標(biāo)記法）31
• 1.3.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)31
• 1.3.11 細(xì)胞小室實(shí)驗(yàn)31-32
• 1.3.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32
• 1.4 結(jié)果32-41
• 1.4.1 成功構(gòu)建 4.1R-Flag與 4.1R-EGFP過表達(dá)質(zhì)粒32-33
• 1.4.2 成功構(gòu)建 4.1R過表達(dá)及沉默穩(wěn)定株（RT-PCR驗(yàn)證）33-34
• 1.4.3 成功構(gòu)建 4.1R過表達(dá)及沉默穩(wěn)定株（WB驗(yàn)證）34-35
• 1.4.4 基因 4.1R過表達(dá)與沉默對DC細(xì)胞形態(tài)的影響35-36
• 1.4.5 基因 4.1R過表達(dá)與沉默對DC表面分子MHCII及表面共刺激分子CD80、CD86的影響36-39
• 1.4.6 基因 4.1R過表達(dá)與沉默對DC細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）39
• 1.4.7 基因 4.1R過表達(dá)與沉默對DC細(xì)胞遷移的影響（Transwell實(shí)驗(yàn)）39-41
• 討論41-43
• 小結(jié)43-45
• 第二部分 探討 4.1R在感染致膈肌無力模型中的表達(dá)及意義45-57
• 2.1 前言45
• 2.2 材料及試劑45-46
• 2.2.1 主要材料和試劑45-46
• 2.2.2 儀器設(shè)備46
• 2.2.3 主要溶液的配制46
• 2.3 方法46-48
• 2.3.1 RT-PCR引物的設(shè)計(jì)與合成46
• 2.3.2 mRNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA46
• 2.3.3 蛋白的提取及BCA測蛋白濃度46
• 2.3.4 免疫印跡雜交46
• 2.3.5 免疫組織化學(xué)染色46-47
• 2.3.6 細(xì)胞免疫組化(DAB顯色)47
• 2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法47-48
• 2.4 結(jié)果48-53
• 2.4.1 4.1R在膈肌無力模型中mRNA水平的表達(dá)48
• 2.4.2 蛋白質(zhì) 4.1R在膈肌無力模型中的表達(dá)48-49
• 2.4.3 蛋白質(zhì) 4.1R明顯促進(jìn)了肌肉收縮蛋白的表達(dá)49-50
• 2.4.5 沉默 4.1R后肌肉乙酰膽堿受體在C2C12細(xì)胞的表達(dá)50-53
• 討論53-55
• 小結(jié)55-57
• 總結(jié)57-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 綜述61-73
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 致謝73-75
• 在讀期間參加的學(xué)術(shù)會議及研究成果75-76

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本文編號：489698