本文關(guān)鍵詞：miR-223-3p通過靶向作用STMN1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和替莫唑胺化療敏感性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是惡性程度和侵襲性最高的中樞神經(jīng)腫瘤之一,約占了所有原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的35-60%。盡管采用標(biāo)準(zhǔn)的治療方式-手術(shù)切除后輔以同期聯(lián)合放化療,腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后效果依然較差,病人的中位生存期只有約14.6個月,是五年生存率最低的腫瘤之一。腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后不良極大程度上是由于腫瘤的快速生長,高度侵襲性和復(fù)發(fā)率。替莫唑胺(TMZ)可使得DNA甲基化的抗腫瘤藥物并且易于通過血腦屏障,被公認(rèn)為是一種對腦膠質(zhì)瘤有良好效果的化療藥。TMZ能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,予以聯(lián)合放療和TMZ化療有利于膠質(zhì)瘤患者提高總體存活率。然而,TMZ的化療耐藥性被認(rèn)為是聯(lián)合放化療效果最主要的問題。STMN1 (Stathmin)是分子量約為19kDa的胞質(zhì)蛋白,它通過阻止微管蛋白的聚合或促進(jìn)微管的解聚作用和突變來調(diào)控細(xì)胞微管蛋白動態(tài),從而影響有絲分裂紡錘體的形成,通過抑制STMN1的表達(dá),可以干擾惡性腫瘤細(xì)胞的有絲分裂,從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。據(jù)文獻(xiàn)報道,腫瘤中STMN1蛋白的表達(dá)水平與患者的預(yù)后效果相關(guān),即STMN1表達(dá)水平越高,患者的存活率越低,并且腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險也越高。研究表明,STMN1高表達(dá)于惡性腫瘤中,并且STMN1的表達(dá)水平與癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明STMN1涉及了腫瘤的化療耐藥性。本課題組發(fā)現(xiàn)STMN1的表達(dá)在TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87TR中顯著高于親本細(xì)胞U87。因此,就STMN1可能與腦膠質(zhì)瘤耐藥的相關(guān)性做深入探討。MicroRNAs(miRNA)是一類只有18～22個堿基長度的非編碼小分子RNA,它是通過轉(zhuǎn)錄后抑制或者降解相應(yīng)的mRNA來調(diào)控特異性的靶蛋白發(fā)揮作用。miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,如：腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥等。通過生物信息學(xué)技術(shù)分析,我們發(fā)現(xiàn)STMN1可能是miR-223-3的潛在靶點。miR-223-3p最初被研究證實是一個造血系統(tǒng)的調(diào)控因子,后被證實在多種腫瘤中呈異常表達(dá)。根據(jù)迄今報告的證據(jù),明確的了miR-223-3p對不同的細(xì)胞過程產(chǎn)生重要的影響,鑒于其對細(xì)胞功能的調(diào)控作用,如增殖、遷移、化療敏感性等,miR-223-3p可能具有改變腫瘤細(xì)胞的表型的潛能,但其中的一些重要的分子機制尚未明確,還需要更深入的研究。因此,本研究目的是為了探討STMN1對膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等生物特性的影響,并且是否通過miR-223-3p靶向調(diào)控,為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新的思路。本課題組在成功構(gòu)建TMZ化療耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87TR的基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87TR檢測STMN1基因和miR-223-3p的表達(dá)水平,并檢測腦膠質(zhì)瘤臨床病例腫瘤組織標(biāo)本中STMN1與miR-223-3p的表達(dá)情況,分析兩者的關(guān)聯(lián)性；利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)分析miR-223-3p與STMN1之間的調(diào)控關(guān)系,在分子水平上驗證了STMN1是miR-223-3p可能的靶向調(diào)控基因,通過在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中過表達(dá)miR-223-3p,驗證miR-223-3p是否對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力產(chǎn)生作用和是否與膠質(zhì)瘤對TMZ化療耐藥的作用；通過在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中干擾STMN1的表達(dá),探討STMN1與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力及TMZ化療敏感性的關(guān)系,明確miR-223-3p對STMN1潛在的調(diào)控作用。本研究分為三個部分：1.TMZ耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中STMN1和miR-223-3p的表達(dá)目的：檢測TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87TR及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級膠質(zhì)瘤(WHO分級)中STMN1的表達(dá),明確STMN1是否與腦膠質(zhì)瘤惡性程度及TMZ化療耐藥相關(guān)。方法：漸次倍增提高親本膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87培養(yǎng)基中TMZ的藥物濃度構(gòu)建TMZ耐藥細(xì)胞株U87TR,采用CCK-8試劑盒檢測U87TR細(xì)胞對不同濃度TMZ的存活率、qRT-PCR和Western blot檢測耐藥相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行其生物學(xué)特性鑒定；qRT-PCR和Western blot檢測STMN1在耐藥細(xì)胞U87TR中的表達(dá),qRT-PCR檢測miR-223-3p耐藥細(xì)胞U87TR中的表達(dá)；收集珠江醫(yī)院神經(jīng)外科和南方醫(yī)院神經(jīng)外科各級別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本(n=31),通過qRT-PCR檢測正常腦組織(n=7)和膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的STMN1的表達(dá),免疫組化分析膠質(zhì)瘤組織STMN1的表達(dá)。采用qRT-PCR檢測正常腦組織(n=7)、Ⅰ-1Ⅱ級(n=10)、Ⅲ級(n=11)和Ⅳ級(n=10)膠質(zhì)瘤(WHO分級)中miR-223-3p的表達(dá),Pearson相關(guān)分析miR-223-3p與STMN1在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)性。結(jié)果：成功構(gòu)建TMZ耐藥細(xì)胞株U87TR,相關(guān)耐藥基因MDR1、BCRP和MRP的mRNA和蛋白在U87TR中的表達(dá)較親本細(xì)胞U87顯著上調(diào),U87TR細(xì)胞株中STMN1表達(dá)水平較親本細(xì)胞U87明顯升高；膠質(zhì)瘤組織中miR-223-3p的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤惡性程度增高顯著降低,并且miR223-3p在TMZ耐藥細(xì)胞株U87TR細(xì)胞中的表達(dá)比親本U87細(xì)胞明顯降低；qRT-PCR及免疫組化結(jié)果顯示級別越高的膠質(zhì)瘤組織STMN1的表達(dá)量越高；Pearson相關(guān)分析顯示miR-223-3p與STMN1在膠質(zhì)瘤中呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：STMN1和miR-223-3p參與膠質(zhì)瘤的耐藥調(diào)節(jié)機制,并與膠質(zhì)瘤的惡性程度存在相關(guān)性。2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-223-3p調(diào)控STMN1的表達(dá)目的：明確膠質(zhì)瘤中STMN1是否為miR-223-3p直接的靶點基因。方法：運用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測分析miR-223-3p在STMN13'UTR端的結(jié)合位點；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-223-3p對STMN1表達(dá)的調(diào)控影響；采用化學(xué)合成核苷酸miR-223-3p mim、NC (miRNA mimics negative control)、 miR-223-3p NC inhibitor和miR-223-3p inhibitor脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞；qRT-PCR和Western blot檢測U251和U87細(xì)胞中STMN1 mRNA和蛋白水平,分析miR-223-3p對STMN1的影響。結(jié)果：膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STMN1基因mRNA的3'UTR是miR-223-3p的直接調(diào)控靶點；膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中miR-223-3p對STMN1的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。結(jié)論：STMN1是miR-223-3p的直接靶點基因。3.miR-223-3p通過靶向作用STMN1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和耐藥性目的：明確miR-223-3p靶向作用STMN1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力及TMZ化療敏感性的影響。方法：應(yīng)用化學(xué)合成核苷酸miR-223-3p mimics、NC (miRNA mimics negative control)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87; qRT-PCR和Western blot檢測miR-223-3p對STMN1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)的影響,CCK8檢測miR-223-3p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用；藥物敏感試驗檢測miR-223-3p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的對TMZ耐藥性的影響；Transwell模型檢測miR-223-3p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用；人工體外合成siRNA-STMN1小干擾RNA經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251; qRT-PCR和Western blot檢測siRNA-STMN1對STMN1基因的mRNA和蛋白質(zhì)的干擾效率；CCK-8檢測siRNA-STMN1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的作用；藥物敏感試驗檢測siRNA-STMN1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的對TMZ化療耐藥性的影響；Transwell模型檢測siRNA-STMN1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的作用。結(jié)果：miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞的STMN1 mRNA和蛋白水平明顯下調(diào),siRNA-STMN1轉(zhuǎn)染后的U251的STMN1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低,siRNA-STMN1對STMN1的干擾效率達(dá)約30%；與NC組相比,miR-223-3p mimics組細(xì)胞增殖的數(shù)量明顯下降,侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量也顯著減少,并且miR-223-3p mimics組細(xì)胞對TMZ的IC50值明顯降低；與siRNA-NC組相比,siRNA-STMN1可減少細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的數(shù)量,并降低對TMZ的IC。結(jié)論：miR-223-3p靶向STMN1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和TMZ敏感性。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 STMN1 miR-223-3p 化療敏感性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-18
• 參考文獻(xiàn)15-18
• 第一部分 替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中STMN1和miR-223-3p的表達(dá)18-46
• 一. 引言18-19
• 二. 材料與方法19-38
• 三. 結(jié)果38-42
• 四. 討論42-43
• 五. 結(jié)論43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 第二部分 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-223-3p調(diào)控STMN1的表達(dá)46-69
• 一. 引言46-47
• 二. 材料與方法47-49
• 三. 實驗方法49-62
• 四. 結(jié)果62-66
• 五. 討論66-67
• 六. 結(jié)論67
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 第三部分 miR-223-3p通過靶向作用STMN1來調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和化療敏感性69-89
• 一. 引言69-70
• 二. 材料與方法70-80
• 三. 結(jié)果80-84
• 四. 討論84-85
• 五. 結(jié)論85
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 全文小結(jié)89-91
• 綜述91-95
• 參考文獻(xiàn)93-95
• 英文縮略詞對照表95-96
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表論文96-97
• 致謝97-98

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：miR-223-3p通過靶向作用STMN1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和替莫唑胺化療敏感性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：475575