本文關(guān)鍵詞：氬氦冷凍聯(lián)合原位注射樹突狀細(xì)胞治療荷膠質(zhì)瘤小鼠的免疫效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤,具有高發(fā)病率及高死亡率的特點(diǎn),其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高,平均生存期約一年。惡性膠質(zhì)瘤治療方法主要以外科手術(shù)切除為主,術(shù)后輔以放療及化療,但由于膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)且對(duì)放化療均不敏感,致使患者平均生存時(shí)間仍無較大改善。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域的不斷進(jìn)步,使得腫瘤免疫治療成為一種很有前景的治療模式,并且已成為手術(shù)治療、放療、化療之后的第4種腫瘤治療的手段。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell, DC)是免疫系統(tǒng)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell, APC),是特異免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。樹突狀細(xì)胞是腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),可有效提呈抗原并活化初始T淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。正常情況下,大多數(shù)樹突狀細(xì)胞以未成熟的狀態(tài)存在于外周組織,表達(dá)低水平的表面共刺激分子、黏附分子,表達(dá)較多的FcR和病原體受體,具有極強(qiáng)的攝取和加工處理抗原的能力。未成熟樹突狀細(xì)胞攝取抗原后將其加工、處理為抗原肽,載入MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物并表達(dá)于樹突狀細(xì)胞的表面,同時(shí)上調(diào)樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子、黏附分子的表達(dá)分化成熟樹突狀細(xì)胞。成熟樹突狀細(xì)胞可識(shí)別并激活腫瘤抗原特異性T細(xì)胞,同時(shí)樹突狀細(xì)胞分泌IL-12等細(xì)胞因子刺激T淋巴細(xì)胞增殖,產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)。目前,腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞后形成的樹突狀細(xì)胞疫苗已經(jīng)應(yīng)用于臨床并取得了較好的療效。樹突狀細(xì)胞疫苗的主要制備方法包括腫瘤抗原多肽致敏樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞提取的DNA或mRNA致敏樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的蛋白提取物致敏樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞因子或趨化因子基因修飾樹突狀細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞互相融合等。氬氦冷凍是近年來興起的一種新的冷凍外科治療手段,具有高效微創(chuàng)性、靶向性、病人痛苦少、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn),而且相對(duì)于液氮冷凍系統(tǒng),使用氬氦冷凍系統(tǒng)具有冷凍速率快、冷熱循環(huán)時(shí)間少、而且氦氣復(fù)溫能迅速阻止冰球進(jìn)一步形成,減少對(duì)周圍組織的損傷等優(yōu)勢(shì),使得氬氦冷凍系統(tǒng)逐步在臨床腫瘤治療上得到就用。氬氦冷凍消融腫瘤后,局部大量組織壞死,這些壞死組織作為腫瘤抗原被未成熟樹突狀細(xì)胞攝取。未成熟樹突狀細(xì)胞分化成熟,并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化增殖。冷凍損傷導(dǎo)致的細(xì)胞壞死,以細(xì)胞崩解和釋放細(xì)胞內(nèi)容物為特點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)容物包括促炎細(xì)胞因子,一些被辨別為Toll樣受體的分子如熱休克蛋白、DNA和RNA,以及“危險(xiǎn)信號(hào)”如尿酸和染色體蛋白HMGB1,它們都具有免疫刺激性,能夠激活并促進(jìn)免疫反應(yīng)。此外,被破壞的組織結(jié)構(gòu)如纖維蛋白原、低聚糖的透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等,同樣具有免疫刺激性。冷凍療法不同于傳統(tǒng)熱療,對(duì)腫瘤內(nèi)部的抗原肽不會(huì)產(chǎn)生大的破壞。這些相對(duì)較完整的腫瘤特異性抗原隨著腫瘤細(xì)胞的裂解被釋放,易被體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞攝取并遞呈給T淋巴細(xì)胞,從而產(chǎn)生細(xì)胞免疫效應(yīng)。近年來大量體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),樹突狀細(xì)胞能有效攝取腫瘤組織冷凍消融后的產(chǎn)物后分化成熟,提高抗原遞呈功能,并有效激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此,基于氬氦冷凍治療腫瘤能提供大量原位抗原以及樹突狀細(xì)胞具有強(qiáng)大的攝取、提呈抗原能力,我們通過氬氦冷凍聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射未成熟樹突狀細(xì)胞治療荷膠質(zhì)瘤小鼠,研究聯(lián)合治療后的抗腫瘤免疫效應(yīng)。本研究選用C57BL/6小鼠及GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為研究對(duì)象,首先,利用GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)未成熟骨髓源DC,流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子的表達(dá)。建立C57BL/6-GL261膠質(zhì)瘤模型,氬氦冷凍治療膠質(zhì)瘤24h后瘤內(nèi)注射未成熟DCs 106個(gè),流式細(xì)胞儀檢測(cè)冷凍外周血CD3+、CD4+、D8+ T細(xì)胞變化；ELISA冷凍治療后血清IL-12含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)冷凍治療后脾臟淋巴細(xì)胞Thl/Th2;CCK-8法檢測(cè)冷凍治療后脾臟CTL毒性；70天后對(duì)幸存小鼠進(jìn)行復(fù)種腫瘤,檢測(cè)是否產(chǎn)生免疫記憶；腫瘤體積變化曲線；生存分析。目的：1.探討建立體外大量擴(kuò)增小鼠骨髓源未成熟樹突狀細(xì)胞(Immature Dendritic Cell, imDC)的方法,為樹突狀細(xì)胞的膠質(zhì)瘤免疫治療提供細(xì)胞來源。2.氬氦冷凍聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射未成熟樹突狀細(xì)胞治療荷膠質(zhì)瘤小鼠后的免疫效應(yīng)。方法：制備小鼠骨髓細(xì)胞,應(yīng)用GM-CSF (10ng/mL)、IL-4 (10ng/l nL)誘導(dǎo)培養(yǎng)未成熟DC,倒置顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,于第5天收集半貼壁細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CDll、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)。建立C57BL/6小鼠膠質(zhì)瘤模型,荷膠質(zhì)瘤小鼠隨機(jī)分成4組,分別為空白對(duì)照組(n=14)、imDC組(n=14)、氬氦冷凍+PBS組(1=15)、氬氦冷凍+imDC組(n=15),流式細(xì)胞儀檢測(cè)冷凍治療前1天、冷凍治療后第10天外周血CD3+、D3+CD4+、 CD3+CD8+T細(xì)胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的變化；ELISA檢測(cè)冷凍治療后第10天血清IL-12含量：流式細(xì)胞儀檢測(cè)冷凍治療后第10天脾臟淋巴細(xì)胞Thl/Th2; CCK-8法檢測(cè)冷凍治療后第10天脾臟細(xì)胞毒性T細(xì)胞毒性反應(yīng)(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL);70天后對(duì)幸存小鼠進(jìn)行復(fù)種腫瘤,檢測(cè)是否產(chǎn)生免疫記憶；每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大長(zhǎng)徑(a)和最大寬徑(b),計(jì)算腫瘤體積大小,繪制腫瘤大小變化曲線；荷膠質(zhì)瘤小鼠生存分析。結(jié)果：利用GM-CSF和IL-4可以從C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC,培養(yǎng)第5天細(xì)胞在形態(tài)上具有未成熟DC的典型特征。培養(yǎng)第5天未成熟DC的CD11c+、CD80+. CD86+及MHC-Ⅱ表達(dá)率分別為CDllc+(80.28±4.94%)、CD80+ (31.58±3.94%)、CD86+(28.31±6.08%),及MHC-II+(64.78±7.63%)。治療后氬氦冷凍+imDC組腫瘤逐漸變小,與空白對(duì)照組、imDC組、氬氦冷凍+PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.000)。以70天為觀察期,觀察期間內(nèi),空白對(duì)照組及imDC組死亡率為100%,空白對(duì)照組平均生存時(shí)間為(39.11±4.86)d,imDC組平均生存時(shí)間為(42.11±6.47)d；氬氦冷凍+PBS組有4只小鼠因腫瘤大小不規(guī)則致冷凍不完全而復(fù)發(fā)死亡,平均生存時(shí)間為(61.30±11.63)d；氬氦冷凍+imDC組無死亡,平均生存時(shí)間為(70)d(P=0.000)。治療前,各組CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+細(xì)胞,以及CD3+CD4+/CD3+CD8+差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.782,P=0.642,P=0.813,P=0.959)。治療10天后,流式檢測(cè)氬氦冷凍+imDC組外周血T淋巴細(xì)胞的表達(dá)：CD3+(50.65±4.42%), CD3+CD4+(32.90±3.76%) 以及 CD3+CD4+/CD3+CD8+(1.99±0.26)明顯高于其它三組P=0.000；P=0.000；P=0.000)；氬氦冷凍+PBS組CD3+, CD3+CD4+細(xì)胞,以及CD3+CD4+/CD3+CD8+高于空白對(duì)照組(40.39±2.17%vs.35.24±1.55%,P=0.014；23.68±1.31%vs.18.48±1.15%,P=0.002；1.52±±0.11 vs.1.19±0.17,P=0.034).治療后imDC組的CD3+, CD3+CD4+雖然也有所升高,但與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(38.57±2.77% vs.35.24±1.55%,P=0.092；21.36±1.79% vs.18.48±1.15%,P=0.060).另外,各組CD3+CD8+T細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.547)。再且,治療后氬氦冷凍+imDC組血清的IL-12水平(132.50±±7.16 pg/mL)明顯高于空白對(duì)照組(37.22±9.16 pg/mL)-imDC組(68.82±6.23 pg/mL)、氬氦冷凍+PBS組(72.95±9.93pg/mL)(P=0.000)。氬氦冷凍+imDC組Thl表達(dá)水平(13.98+2.52%)在術(shù)后第10d顯著高于其它三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。不同效靶比時(shí)氬氦冷凍+imDC組CTLs對(duì)GL261細(xì)胞的殺傷率顯著高于空白對(duì)照組、imDC組、氬氦冷凍+PBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。結(jié)論：1.利用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)并通過手法篩選初步純化可以從C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞中獲得較高純度小鼠骨髓源未成熟樹突狀細(xì)胞,是一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的未成熟樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)方法,為DC的腫瘤免疫治療提供了細(xì)胞來源。2.在氬氦冷凍降低腫瘤負(fù)荷的基礎(chǔ)上,聯(lián)合原位注射未成熟DC能夠有效利用凍融腫瘤細(xì)胞釋放出的腫瘤抗原,體內(nèi)完成DC抗原負(fù)載,誘導(dǎo)抗腫瘤特異性免疫反應(yīng),為氬氦冷凍免疫治療膠質(zhì)瘤提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：氬氦冷凍 樹突狀細(xì)胞 膠質(zhì)瘤 T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 一、前言15-19
• 二、材料方法19-29
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料和試劑19-22
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 三、結(jié)果29-37
• 1. 樹突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察29
• 2. DC的純度及表型29-30
• 3. 腫瘤體積大小變化曲線及生存分析30-31
• 4. 外周血T淋巴細(xì)胞的亞群檢測(cè)31-33
• 5. 治療后血清IL-12水平33
• 6. TH1/TH2免疫反應(yīng)33-35
• 7. 細(xì)胞毒性試驗(yàn)35-37
• 四、討論37-42
• 1. 腫瘤免疫逃避特點(diǎn)37
• 2. 未成熟DC的培養(yǎng)及鑒定37-39
• 3. 氬氦冷凍治療腫瘤39-40
• 4. 氬氦冷凍聯(lián)合原位注射未成熟樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)抗膠質(zhì)瘤免疫40-42
• 五、結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-52
• 綜述52-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 中英文縮略詞對(duì)照表65-66
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表論文66-67
• 致謝67-68

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭嘉麗;白介素-1β在石英致肺臟、心臟、腎臟炎性和纖維化反應(yīng)過程中的作用及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2013年

2 郭嘉麗;白介素-1β在石英致肺臟、心臟、腎臟炎性和纖維化反應(yīng)過程中的作用及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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3 吳家祥;超聲引導(dǎo)冷凍對(duì)局部瘢痕與炎癥的影響及在乳腺良性病變的應(yīng)用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：473711