本文關(guān)鍵詞：microRNA-155靶向PICALM抑制腸道病毒71型在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腸道病毒71型(EV71)屬微小RNA病毒科腸道病毒屬A組,是引起手足口病的主要病原體之一。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約20-24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA,miRNA不編碼蛋白,而是通過與mRNA的3'端非編碼區(qū)或編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,降解或者抑制mRNA的翻譯來抑制基因的表達(dá)。在EV71感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH)miRNA差異表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用miRNA(模擬體)mimic和miRNA(抑制體)inhibitor篩選并驗(yàn)證了對EV71有調(diào)控作用的miRNA-155(miR-155),并進(jìn)一步闡明了miR-155通過靶向PICALM抑制EV71在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制。方法:(1)收集感染EV71前后的SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞,提取總RNA,利用miRNA芯片得出EV71感染SK-N-SH前后差異miRNA表達(dá)譜,篩選EV71感染SK-N-SH前后顯著差異的miRNA;并利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(QRT-PCR)驗(yàn)證芯片結(jié)果。(2)利用miRNA mimic和miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞,改變miRNA水平,利用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)觀察、病毒滴度TCID50測定、QRT-PCR、Western blotting(WB)等方法,與陰性對照組和空白對照組比較EV71病毒復(fù)制的變化,驗(yàn)證mi RNA對EV71在SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞中復(fù)制的調(diào)控作用。(3)利用miRNA的靶基因數(shù)據(jù)庫mi Randa,TargetScan和miRbase,篩選miRNA的靶基因,雙熒光素報(bào)告酶法驗(yàn)證miRNA的靶基因。利用靶基因的過表達(dá)載體和小干擾RNA(si-RNA)分別上調(diào)和下調(diào)靶基因的表達(dá)后,觀察miRNA對EV71調(diào)控作用的變化,驗(yàn)證miRNA通過靶向基因調(diào)控EV71在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制。結(jié)果:(1)在EV71感染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞后,mi RNA芯片和qRT-PCR結(jié)果均顯示miRNA-155的表達(dá)水平顯著上升,且mi R-155的上升與EV71病毒的感染量、感染時(shí)間均呈正相關(guān)。(2)mi RNA-155 mimic轉(zhuǎn)染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞后,miR-155水平顯著上升,與陰性對照相比,EV71在SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制被抑制。同時(shí),miR-155對EV71病毒復(fù)制的抑制作用與miR-155的表達(dá)水平呈正相關(guān)。(3)利用miRBase等生物學(xué)軟件并結(jié)合基因功能,篩選出miR-155的候選靶基因PICALM。在EV71病毒感染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞后,PICALM基因的蛋白水平明顯下降。利用PICALM的過表達(dá)載體和siRNA分別上調(diào)和下調(diào)該基因表達(dá),結(jié)果顯示,過表達(dá)PICALM基因能夠減少miR-155對EV71的抑制作用,而下調(diào)PICALM基因的表達(dá)能夠進(jìn)一步抑制EV71的復(fù)制。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)miR-155通過靶向PICALM抑制EV71在SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：miR-155 EV71 PICALM SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 緒論13-30
• 1.1 腸道病毒71型13-18
• 1.1.1 概述13-14
• 1.1.2 EV71復(fù)制與感染14-15
• 1.1.3 EV71的致病機(jī)理15-16
• 1.1.4 EV71感染的相關(guān)疾病16
• 1.1.5 EV71流行概況16-17
• 1.1.6 EV71的實(shí)驗(yàn)室診斷和治療17-18
• 1.2 微小RNA（MIRNA）18-20
• 1.2.1 概述18
• 1.2.2 成熟miRNA的生物合成18-19
• 1.2.3 成熟miRNA的作用機(jī)制19-20
• 1.3 MIRNA與EV71的相互作用20-26
• 1.3.1 概述20-21
• 1.3.2 miRNA與EV71的相互作用21-24
• 1.3.3 EV71與其它腸道病毒的作用24-26
• 1.4 磷脂酰肌醇結(jié)合網(wǎng)格蛋白組裝蛋白(PICALM)26-27
• 1.4.1 概述26
• 1.4.2 PICALM在病毒感染過程中的作用26-27
• 1.5 研究目的，方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和意義27-30
• 1.5.1 研究目的27
• 1.5.2 研究方法27-29
• 1.5.3 研究意義29-30
• 第二章 EV71感染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞引起MIR-155的水平上升30-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料30-34
• 2.1.1 主要試劑30-32
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器32-33
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)材料33
• 2.1.4 主要溶液配制33-34
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)34-35
• 2.2.2 EV71傳代35
• 2.2.3 EV71滴度TCID50檢測35-36
• 2.2.4 miRNA基因芯片36
• 2.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證miRNA基因芯片結(jié)果36-38
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-42
• 2.3.1 miRNA表達(dá)譜差異分析38-39
• 2.3.2 QRT-PCR驗(yàn)證EV71感染前后miR-155的表達(dá)39-40
• 2.3.3 miR-155的表達(dá)水平與EV71感染時(shí)間呈正相關(guān)40-41
• 2.3.4 miR-155的表達(dá)水平與EV71感染滴度呈正相關(guān)41-42
• 第三章 MIR-155能抑制EV71在神經(jīng)細(xì)胞SK-N-SH中的復(fù)制42-53
• 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法42-47
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)42
• 3.2.2 miRNA的轉(zhuǎn)染42-43
• 3.2.3 miRNA轉(zhuǎn)染效率的測定43
• 3.2.4 QRT-PCR檢測miRNA抑制EV71病毒核酸43-44
• 3.2.5 Western blot檢測miRNA抑制EV71復(fù)制的能力44-46
• 3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析46-47
• 3.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-53
• 3.3.1 miR-155 mimic轉(zhuǎn)染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞后引起miR-155水平升高47-48
• 3.3.2 miR-155減緩了細(xì)胞的病變效應(yīng)（CPE）48-49
• 3.3.3 miR-155降低了EV71的病毒滴度49-50
• 3.3.4 miR-155抑制EV71核酸的復(fù)制50-51
• 3.3.5 miR-155抑制EV71 VP1蛋白的表達(dá)51-53
• 第四章 MIR-155通過靶向PICALM抑制EV71的復(fù)制53-76
• 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法53-63
• 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)53
• 4.2.2 miRNA的轉(zhuǎn)染53
• 4.2.3 相關(guān)質(zhì)粒圖譜53-54
• 4.2.4 miR-155與PICALM靶向關(guān)系的驗(yàn)證54-62
• 4.2.5 PICALM過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建62
• 4.2.6 PICALM干擾基因的驗(yàn)證62-63
• 4.2.7 QRT-PCR檢測PICALM mRNA的表達(dá)63
• 4.2.8 Western blotting檢測PICALM蛋白的表達(dá)63
• 4.2.9 QRT-PCR檢測EV71 mRNA的表達(dá)63
• 4.2.10 Western blotting檢測EV71蛋白的表達(dá)63
• 4.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析63
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-76
• 4.3.1 miR-155靶基因PICALM的驗(yàn)證63-65
• 4.3.2 EV71感染后，PICALM蛋白水平下降65-66
• 4.3.3 PICALM下調(diào)抑制EV71的復(fù)制66-70
• 4.3.4 miR-155通過靶向PICALM抑制EV71的復(fù)制70-73
• 4.3.5 討論73-76
• 第五章 結(jié)論及展望76-77
• 5.1 結(jié)論76
• 5.2 展望76-77
• 參考文獻(xiàn)77-86
• 致謝86-88
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章88-89

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1 吳靜;microRNA-155靶向PICALM抑制腸道病毒71型在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制[D];江蘇大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-155靶向PICALM抑制腸道病毒71型在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：463418