本文關(guān)鍵詞：ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及CnAα4的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景神經(jīng)退行性疾病的治療在臨床上缺少有效的方法,因此需要尋找新的與神經(jīng)保護相關(guān)的分子靶點。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CN)是目前唯一受Ca2+和鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)調(diào)控的蛋白磷酸酶,由催化亞基CnA和調(diào)節(jié)亞基CnB組成,能夠活化活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT),與細胞凋亡有著密切的關(guān)系。含錨蛋白重復序列和IBR結(jié)構(gòu)域蛋白1(ankyrin repeat and IBR domain containing 1, ANKIB1)含有一個CN的結(jié)合位點,其與細胞凋亡之間的關(guān)系尚缺乏研究。CnAa4是一種新的人CnAl轉(zhuǎn)錄本,其編碼蛋白的功能未見報道。目的1、探索ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋亡的影響及可能機制；2、揭示CnAa4的功能。方法1、Western印跡檢測ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋亡的影響將pCMV-Myc-ANKIB1轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞后,向培養(yǎng)液中加入百草枯,western印跡檢測細胞裂解液中活化的caspase3、失活的PARP和p-IκB的水平。2、ANKIB1與CaM的關(guān)系首先用pull down和Co-IP證明ANKIB1與CaM相互作用,然后調(diào)整反應體系中游離的Ca2+濃度,研究Ca2+對二者相互作用的影響。將pFLAG-CMV-CaM和pCMV-Myc-ANKIB1共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,48 h后對qPCR和western印跡分析CaM對ANKIB1基因表達的影響。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實驗研究CaM對ANKIB1蛋白穩(wěn)定性的影響。3、雙熒光素酶報告基因分析ANKIB1對NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的影響將pCMV-Myc-ANKIB1轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,24 h后向培養(yǎng)液中加入離子霉素(2μ.M)或者環(huán)孢菌素A(2μM)處理6 h,然后雙熒光素酶報告基因分析ANKIB1對NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。4、CnAa4功能鑒定Pull down檢測CnAa4與CaM的結(jié)合能力,免疫熒光分析CnAa4對NFAT核轉(zhuǎn)位的影響,雙熒光素酶報告基因分析CnAa4對NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。結(jié)果1、轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-ANKIB1的SH-SY5Y細胞經(jīng)百草枯處理之后活化的caspase3和失活的PARP水平較對照組均有所降低；2. ANKIB1與CaM相互作用,不同濃度的Ca2+CaM-agarose上結(jié)合的ANKIB1的量有差別,CaM通過增強ANKIB1的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)ANKIB1基因的表達；3、ANKIB1能夠抑制NFAT的轉(zhuǎn)錄因子活性；4、CnAa4具有與CnAal相似的CaM親和力,能夠促進NFATc1的核轉(zhuǎn)位,較CnAα1有更強的激活NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的能力。結(jié)論1、ANKIB1與CaM相互作用,抑制NFAT的轉(zhuǎn)錄因子活性,對百草枯誘導的SH-SY5Y細胞凋亡有保護作用。2、CnAa4和CnAα1有相似的CaM親和性,具有比CnAα1更強的磷酸酶活性。
【關(guān)鍵詞】：ANKIB1 細胞凋亡 NFAT CnAα4 功能
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第一部分 ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋亡的影響11-25
• 1 材料和方法11-15
• 2 結(jié)果15-22
• 3 討論22-25
• 第二部分 CnA-α4的功能分析25-31
• 1 材料和方法25-26
• 2 結(jié)果26-28
• 3 討論28-31
• 結(jié)論31
• 參考文獻31-34
• 綜述 NFAT的調(diào)節(jié)及其功能34-46
• 參考文獻40-46
• 附錄46-50
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況50-51
• 致謝51-53
• 個人簡歷53

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