本文關(guān)鍵詞：羅非魚(yú)Foxp3表達(dá)細(xì)胞及其在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎（EAE）中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在哺乳類,大量研究表明,Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells, Tr)發(fā)生、發(fā)育及發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素,在誘導(dǎo)和維持免疫耐受及免疫抑制功能中具有決定性作用。一直以來(lái),Foxp3被認(rèn)為限制性表達(dá)于CD4+CD25+Tr細(xì)胞中,但最近研究顯示,在非淋巴組織如乳房、肺、前列腺等上皮細(xì)胞及多種非血源性腫瘤細(xì)胞均可檢測(cè)到Foxp3的表達(dá),從而表明,Foxp3除具有免疫調(diào)節(jié)功能外,可能在腫瘤的發(fā)生及演化等方面具有廣泛的生物學(xué)功能。硬骨魚(yú)類擁有與哺乳動(dòng)物類似的T、B淋巴細(xì)胞,其抗原受體通過(guò)與哺乳動(dòng)物類似的機(jī)制進(jìn)行基因片段的隨機(jī)組合、連接及突變產(chǎn)生。理論上,硬骨魚(yú)類也能產(chǎn)生大量自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞,但是否具有與哺乳動(dòng)物類似的功能性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞及其分子如Foxp3,目前尚不明了。迄今,已相繼從斑馬魚(yú)、虹鱒、大西洋鮭魚(yú)、河豚、羅非魚(yú)分離鑒定了Foxp3同源分子,但主要局限于mRNA水平的研究。硬骨魚(yú)類Foxp3是否具有與哺乳類類似的細(xì)胞表達(dá)模式,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。在前期研究中,我們從羅非魚(yú)(在本研究中,如未特殊說(shuō)明,研究用的羅非魚(yú)均指尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus))分離并鑒定了Foxp3,并對(duì)其特異性片段(s-ntFoxp3)進(jìn)行了原核表達(dá)�；诖�,本研究通過(guò)進(jìn)一步純化s-ntFoxp3重組蛋白,制備了抗羅非魚(yú)Foxp3兔源多克隆抗體(α Foxp3),通過(guò)SDS-PAGE、Western blot檢測(cè)其特異性,并通過(guò)免疫組化、流式細(xì)胞儀等對(duì)其細(xì)胞表達(dá)模式進(jìn)行深入研究；另一方面,通過(guò)自身腦抗原免疫,構(gòu)建羅非魚(yú)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型,檢查Foxp3在EAE發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中不同組織的表達(dá)變化情況,以期對(duì)其生物學(xué)作用進(jìn)行探討。主要研究結(jié)果如下：1) SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,獲得的純化重組蛋白s-ntFoxp3分子量大小與預(yù)期相符,Western blotting檢測(cè)表明,在胸腺、脾、頭腎、腸、腎、胃、鰓中均見(jiàn)與預(yù)測(cè)大小(約44 kD)相符的明顯條帶,而在肌肉組織中未見(jiàn)陽(yáng)性條帶,此結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相吻合,從而表明,α Foxp3具有較強(qiáng)的特異性。2)免疫組化結(jié)果顯示,在體外分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中,Foxp3表達(dá)于部分淋巴樣細(xì)胞,并主要定位于細(xì)胞核；流式細(xì)胞儀分析表明,正常成年羅非魚(yú)PBMC中Foxp3+細(xì)胞所占百分率為5.7±2.0%(n=5)；有絲分裂原植物血凝素(PHA)體外刺激PBMC 6.12和24小時(shí)后,PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率分別為21.9、19.1、7.86%,而未刺激組分別為738、6.47、2.70%。3)在免疫相關(guān)組織如胸腺、脾、頭腎等,Foxp3主要表達(dá)于血源性淋巴樣細(xì)胞；在非淋巴組織胃中,在非血源性的黏膜上皮細(xì)胞觀察到Foxp3的陽(yáng)性表達(dá)。4)用羅非魚(yú)腦組織勻漿液與弗氏不完全佐劑充分乳化后,腹腔注射免疫羅非魚(yú),不同時(shí)間點(diǎn)觀察羅非魚(yú)行為、體重變化,結(jié)果顯示,免疫后第12d左右,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組魚(yú)行動(dòng)減緩,反應(yīng)遲鈍、攝食量減少且體重增加量明顯降低；HE染色觀察腦組織、腎、腸、肝的病理變化,結(jié)果顯示,免疫后第1、3、6、7、9d實(shí)驗(yàn)組魚(yú)腦組織未見(jiàn)明顯病理變化,第12d后,實(shí)驗(yàn)組魚(yú)腦組織出現(xiàn)了類似于哺乳動(dòng)物EAE的典型病理特征,即淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、腦膜增厚、血管袖套樣等。此外,其他免疫相關(guān)組織也觀察到不同程度的病理變化,主要為充血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。上述結(jié)果顯示,通過(guò)腦抗原的自身免疫后羅非魚(yú)出現(xiàn)了自身免疫性疾病,從而表明羅非魚(yú)EAE模型構(gòu)建成功。5)羅非魚(yú)腦組織自身抗原免疫后,分離不同時(shí)間點(diǎn)的PBMC,流式細(xì)胞儀檢測(cè)Foxp3+細(xì)胞頻率,結(jié)果顯示,免疫后第1-12 d,PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率顯著升高,第1、12d分別為63.6%、16.2%,而對(duì)照組分別為13.5%、7.98%,第15d開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率明顯低于對(duì)照組,第13、15、18d,PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率分別為8%、3.34%、2.78%,對(duì)照組分別為,7.05%、5.37%、5.93%;real-timePCR及免疫組化分別檢測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)脾、頭腎、腎中foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,第12d前各組織Foxp3的表達(dá)均明顯上調(diào),第15 d Foxp3的表達(dá)顯著減少,此結(jié)果與流式細(xì)胞儀結(jié)果一致。從而表明,在低等脊椎動(dòng)物羅非魚(yú)中,Foxp3的表達(dá)與自身免疫性疾病EAE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究一方面成功制備了羅非魚(yú)Foxp3的特異性抗體并檢測(cè)了淋巴組織和非淋巴組織中的細(xì)胞表達(dá)類型,首次證實(shí)硬骨魚(yú)類Foxp3不僅表達(dá)于血源性的淋巴樣細(xì)胞而且表達(dá)于非淋巴組織的非血源性細(xì)胞。硬骨魚(yú)與哺乳類Foxp3保守的細(xì)胞水平表達(dá)模式提示其可能具有保守的生物學(xué)功能；另一方面,成功構(gòu)建了羅非魚(yú)自身免疫性疾病模型,并通過(guò)多種方法檢測(cè)了其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Foxp3的表達(dá),提示在低等脊椎動(dòng)物中Foxp3可能在自身免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：羅非魚(yú) Foxp3 淋巴樣細(xì)胞 非血源性細(xì)胞 EAE
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R744.51
【目錄】：

• 英文縮略詞7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1 硬骨魚(yú)類免疫13-20
• 1.1 主要免疫組織和器官14-17
• 1.2 T細(xì)胞表面特異分化抗原17-20
• 2 Foxp3研究現(xiàn)狀及其在自身免疫性疾病中的表達(dá)20-22
• 2.1 Foxp3研究現(xiàn)狀20-21
• 2.2 自身免疫性疾病21-22
• 2.3 EAE22
• 4 科學(xué)問(wèn)題的提出和本研究的目的意義22-25
• 第2章 羅非魚(yú)Foxp3表達(dá)細(xì)胞25-43
• 1 前言25
• 2 材料、儀器25-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器26
• 3 實(shí)驗(yàn)方法26-33
• 3.1 重組蛋白表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)26-27
• 3.2 多克隆抗體制備27
• 3.3 組織表達(dá)模式分析27-28
• 3.4 Western blot28-29
• 3.5 PBMC中Foxp3的表達(dá)29-32
• 3.6 免疫組化32-33
• 4 結(jié)果與分析33-40
• 4.1 重組蛋白表達(dá)與SDS-PAGE結(jié)果33-34
• 4.2 組織表達(dá)模式分析34
• 4.3 Western blot檢測(cè)34-35
• 4.4 PBMC中Foxp3的表達(dá)35-37
• 4.5 免疫相關(guān)組織中Foxp3細(xì)胞表達(dá)定位37-38
• 4.6 胸腺中Foxp3的細(xì)胞表達(dá)38-39
• 4.7 非免疫組織中Foxp3的細(xì)胞定位39-40
• 5 討論40-43
• 第3章 羅非魚(yú)Foxp3在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎(EAE)的作用43-59
• 1 前言43
• 2 材料、儀器43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物43
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器43
• 3 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)組設(shè)置及免疫43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料的收集與保存44
• 3.3 免疫組織組織學(xué)觀察44-45
• 3.4 免疫組織Foxp3組織表達(dá)模式分析45-46
• 4 結(jié)果與分析46-55
• 4.1 自身免疫性疾病模型構(gòu)建46-49
• 4.1.1 腦組織病理染色觀察46-47
• 4.1.2 羅非魚(yú)體重及行為變化47-48
• 4.1.3 免疫后病理組織染色48-49
• 4.2 Foxp3表達(dá)變化49-55
• 4.2.1 PBMC中Foxp3表達(dá)變化49-51
• 4.2.2 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)免疫組織foxp3mRNA水平表達(dá)量的檢測(cè)51-52
• 4.2.3 免疫組化檢測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)免疫組織中Foxp3的表達(dá)變化52-55
• 5 討論55-59
• 結(jié)論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-75
• 致謝75-77
• 在讀期間所發(fā)表的論文77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 王衛(wèi)衛(wèi);吳謖琦;孫修勤;樊廷俊;;硬骨魚(yú)免疫系統(tǒng)的組成與免疫應(yīng)答機(jī)制研究進(jìn)展[J];海洋科學(xué)進(jìn)展;2010年02期

2 鐘明超，黃浙;鲇魚(yú)淋巴樣器官的發(fā)育[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);1995年03期

3 羅曉春,李安興,謝明權(quán);斜帶石斑魚(yú)黏膜免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的研究[J];水生生物學(xué)報(bào);2005年02期

4 劉云,姜國(guó)良,張士璀,姜明,連建華;牙鲆的頭腎免疫細(xì)胞[J];中國(guó)水產(chǎn)科學(xué);2001年04期

  本文關(guān)鍵詞：羅非魚(yú)Foxp3表達(dá)細(xì)胞及其在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎（EAE）中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：379940