發(fā)布時間：2017-05-19 08:22

  本文關鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)源性IL-6調(diào)節(jié)OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞分離共培養(yǎng)對OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的影響目的利用氧糖剝奪(OGD)損傷的星形膠質(zhì)細胞與MSCs分離共培養(yǎng)模型,探討MSCs對OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的影響。方法原代大鼠培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,利用星形膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP對其進行鑒定。建立星形膠質(zhì)細胞OGD損傷模型,并與MSCs分離共培養(yǎng),同時以未損傷星形膠質(zhì)細胞(control組)和單獨OGD損傷組(OGD組)為對照。ELISA檢測共培養(yǎng)上清中IL-6分泌情況,Real-time PCR和western blot分別檢測IL-6信號通路相關因子及Bcl-2. Bax凋亡相關因子的mRNA及蛋白表達變化。鈣影像系統(tǒng)檢測ATP刺激后不同處理組星形膠質(zhì)細胞胞中Ca2+濃度,CCK-8試劑盒檢測星形膠質(zhì)細胞的增殖狀況。結果(1)經(jīng)GFAP免疫熒光方法鑒定,原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞純度超過95%。(2)ELISA檢測顯示MSCs分離共培養(yǎng)后的損傷星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)液中IL-6的分泌水平明顯高于OGD組(P0.05)。(3)與MSCs分離共培養(yǎng)后,OGD損傷的星形膠質(zhì)細胞中凋亡因子Bcl-2表達水平顯著升高(P0.01), Bax表達水平略有降低,但Bcl-2/Bax的表達水平比值卻明顯高于其他兩組(P0.05)。(4) MSCs共培養(yǎng)誘導損傷星形膠質(zhì)細胞中IL-6信號通路相關分子IL-6R和STAT3在mRNA和蛋白表達水平均呈現(xiàn)顯著上調(diào)。(5)與control組相比,ATP刺激可誘導OGD損傷的星形膠質(zhì)細胞胞內(nèi)Ca2+水平瞬間升高(P0.001),而MSCs分離共培養(yǎng)可顯著降低OGD損傷細胞內(nèi)Ca2+水平(P0.05)。(6)OGD損傷后星形膠質(zhì)細胞增殖加速,而MSCs分離共培養(yǎng)可抑制損傷的星形膠質(zhì)細胞增殖能力。結論OGD損傷導致星形膠質(zhì)細胞Bcl-2/Bax表達水平比值下降,胞內(nèi)Ca2+濃度增加,細胞增殖能力上調(diào)；而MSCs分離共培養(yǎng)上調(diào)共培養(yǎng)上清中IL-6分泌水平,激活OGD損傷星形膠質(zhì)細胞中IL-6R/STAT3信號通路,提高Bcl-2/Bax的比值,降低損傷細胞胞內(nèi)Ca2+釋放,抑制損傷星形膠質(zhì)細胞增殖。第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)源性IL-6對星形膠質(zhì)細胞損傷修復的調(diào)節(jié)目的利用siIL-6 MSCs穩(wěn)定細胞株,與OGD損傷星形膠質(zhì)細胞分離共培養(yǎng),闡明MSCs內(nèi)源性IL-6對損傷星形膠質(zhì)細胞的作用。方法將siIL-6 MSCs細胞與OGD損傷星形膠質(zhì)細胞分離共培養(yǎng),并以GFP MSCs為對照,ELISA測定共培養(yǎng)上清中IL-6分泌水平,Real-time PCR和western blotting分別檢測IL-6信號通路關鍵分子IL-6R、STAT3及凋亡相關因子Bcl-2、Bax的mRNA及蛋白表達水平,鈣影像系統(tǒng)測定分離共培養(yǎng)后損傷星形膠質(zhì)細胞胞內(nèi)Ca2+濃度變化情況,CCK-8試劑盒檢測損傷星形膠質(zhì)細胞的增殖情況。結果(1)siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)可明顯下調(diào)培養(yǎng)上清IL-6的分泌水平(P0.01)。(2)siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后,OGD損傷星形膠質(zhì)細胞中IL-6信號通路關鍵分子IL-6R與p-STAT3表達水平均顯著下降(P0.01,P0.01)。(3) OGD損傷星形膠質(zhì)細胞與siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后,其凋亡因子Bcl-2的表達水平明顯低于GFP MSCs組(P 0.01), Bax表達水平略有增高,但Bcl-2/Bax的表達水平比值顯著減小,與GFP MSCs組比較具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。(4) ATP可誘導與siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后的損傷星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+釋放明顯增加(P0.05)。(5)siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)促進損傷星形膠質(zhì)細胞增殖能力增強。結論當MSCs中IL-6分泌水平下降時,與其共培養(yǎng)的OGD損傷星形膠質(zhì)細胞IL-6R/STAT3信號通路活性減弱,Bcl-2/Bax表達水平比值下降,胞內(nèi)Ca2+釋放增加,細胞增殖能力增強。第三部分外源性細胞因子IL-6對OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的影響目的應用外源性細胞因子IL-6干預OGD損傷的星形膠質(zhì)細胞,比較重組細胞因子IL-6與MSCs內(nèi)源性分泌IL-6對損傷星形膠質(zhì)細胞的作用。方法將重組細胞因子IL-6處理OGD損傷星形膠質(zhì)細胞48h,并以IL-6未處理的OGD損傷星形膠質(zhì)細胞為對照,ELISA測定培養(yǎng)上清中IL-6的濃度,western blotting檢測兩組損傷星形膠質(zhì)細胞中IL-6信號通路關鍵分子IL-6R、STAT3及凋亡相關因子Bcl-2、Bax的蛋白表達水平變化。鈣影像系統(tǒng)測定損傷星形膠質(zhì)細胞中Ca2+濃度,CCK-8試劑盒檢測損傷星形膠質(zhì)細胞的增殖情況。結果(1)IL-6干預后,細胞培養(yǎng)上清中IL-6的濃度盡管較單獨OGD損傷組有所增高,但經(jīng)統(tǒng)計學分析無顯著差異(P0.05)。(2)外源性IL-6可顯著上調(diào)IL-6R及磷酸化STAT3的表達水平。(3)IL-6干預組細胞凋亡因子Bcl-2的蛋白表達水平明顯升高,Bax的表達水平顯著降低,Bcl-2/Bax表達水平比值顯著增加,與OGD損傷組比較具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。(4)ATP刺激可明顯誘導IL-6干預組中OGD損傷星形膠質(zhì)細胞胞內(nèi)Ca2+濃度的升高,但其升高幅度與單獨OGD損傷組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(5)損傷星形膠質(zhì)細胞的增殖能力在兩組間無明顯差異。結論外源性IL-6可誘導IL-6R/STAT3信號通路激活,增加Bcl-2/Bax表達水平比值,從而增強OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的抗凋亡能力。但重組細胞因子IL-6并不影響損傷星形膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中Ca2+的水平,以及活性星形膠質(zhì)細胞增殖能力。
【關鍵詞】：OGD損傷 骨髓間充質(zhì)干細胞 星形膠質(zhì)細胞 白細胞介素-6信號通路 凋亡因子 siIL-6 MSCs 分離共培養(yǎng) 白細胞介素-6 凋亡 鈣影像 Ca~(2+) 增殖 重組細胞因子IL-6 OGD損傷 IL-6信號通路 抗凋亡
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-22
• 參考文獻19-22
• 第一部分 骨髓間充質(zhì)干細胞分離共培養(yǎng)對OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的影響22-46
• 1 材料與方法22-34
• 2 結果34-40
• 3 討論40-42
• 4 小結42-43
• 參考文獻43-46
• 第二部分 骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)源性IL-6對星形膠質(zhì)細胞損傷修復的調(diào)節(jié)46-59
• 1 材料與方法46-47
• 2 結果47-52
• 3 討論52-54
• 4 小結54-55
• 參考文獻55-59
• 第三部分 外源性細胞因子IL-6對OGD損傷星形膠質(zhì)細胞的影響59-68
• 1 材料與方法59-60
• 2 結果60-64
• 3 討論64-65
• 4 小結65-66
• 參考文獻66-68
• 全文總結68-69
• 文獻綜述69-85
• 參考文獻76-85
• 致謝85-86
• 碩士期間發(fā)表的學術論文目錄86

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