淀粉樣蛋白的錯(cuò)誤折疊和異常聚集是2型糖尿病、阿茲海默病、海綿狀腦病等淀粉樣變性病的重要致病原因之一。淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性主要來(lái)源于淀粉樣蛋白的聚集、氧化壓力的產(chǎn)生以及與細(xì)胞膜的相互作用；細(xì)胞毒性的產(chǎn)生過(guò)程會(huì)受到翻譯后修飾、金屬離子、共存蛋白以及二維細(xì)胞膜表面等多種因素的調(diào)控。在本論文中，我們重點(diǎn)研究了磷酸化和泛素化等翻譯后修飾、金屬銅離子、二維負(fù)電表面等因素對(duì)淀粉樣蛋白細(xì)胞毒性產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)理，并同時(shí)著重對(duì)蛋白定點(diǎn)泛素化合成的新方法進(jìn)行了探索。本研究對(duì)理解淀粉樣變性病病理機(jī)理具有重要意義，且為相應(yīng)的治療手段和藥物的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。 我們首先利用高效原子力顯微鏡和石英微天平技術(shù)，對(duì)胰島淀粉樣多肽（hIAPP）和胰島素（Insulin）在五氧化二鉭表面以不同比例共聚集的過(guò)程和形貌特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同比率的hIAPP/Insulin在負(fù)電表面形成不同的聚集納米結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為成熟纖維-寡聚體纖維-寡聚體-前體原纖維-環(huán)狀纖維等形式。石英晶體微天平表征結(jié)果顯示蛋白共混后對(duì)表面的吸附作用更強(qiáng)。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究2型糖尿病的病理機(jī)理有重要的參考價(jià)值。 我們利用多肽固相合成方... 

【文章頁(yè)數(shù)】：112 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第1章 引言
    1.1 淀粉樣蛋白及其介導(dǎo)的淀粉樣相關(guān)疾病
        1.1.1 胰島淀粉樣多肽與 2 型糖尿病
        1.1.2 Tau 蛋白與阿茲海默病
        1.1.3 阮病毒蛋白與海綿狀腦病
        1.1.4 淀粉樣蛋白的主要細(xì)胞毒性來(lái)源
            1.1.4.1 淀粉樣蛋白與聚集
            1.1.4.2 淀粉樣蛋白與氧化壓力
            1.1.4.3 淀粉樣蛋白與細(xì)胞膜的作用
    1.2 金屬銅離子對(duì)淀粉樣相關(guān)蛋白致病機(jī)理的調(diào)控
        1.2.1 活性氧的產(chǎn)生與氧化壓力
        1.2.2 金屬銅離子與 Tau 蛋白及重復(fù)片段的相互作用
        1.2.3 金屬銅離子介導(dǎo) Tau 蛋白及其重復(fù)片段產(chǎn)生氧化壓力
    1.3 翻譯后修飾對(duì)淀粉樣相關(guān)蛋白致病機(jī)理的調(diào)控
        1.3.1 磷酸化在 Tau 蛋白介導(dǎo)阿茲海默病過(guò)程中的作用
        1.3.2 淀粉樣相關(guān)蛋白的泛素化修飾
        1.3.3 定點(diǎn)泛素化修飾蛋白的體外合成方法學(xué)研究進(jìn)展
    1.4 問(wèn)題的提出和本論文主要研究的內(nèi)容
第2章 胰島淀粉樣多肽與胰島素在氧化鉭表面共聚集性質(zhì)的研究
    2.1 本章引論
        2.1.1 淀粉樣蛋白與二維界面相互作用的研究進(jìn)展
        2.1.2 胰島淀粉樣多肽與胰島素相互作用的研究進(jìn)展
        2.1.3 淀粉樣蛋白聚集體的不同組裝形式
        2.1.4 本課題的提出
    2.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法
        2.2.1 高效液相原子力顯微鏡技術(shù)
        2.2.2 石英晶體微天平技術(shù)
        2.2.3 本課題所用試劑和儀器
        2.2.4 樣品制備與實(shí)驗(yàn)操作
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.3.1 模擬生物膜表面的五氧化二鉭二維界面模型的構(gòu)建
        2.3.2 模擬生理環(huán)境研究表面聚集過(guò)程模型的構(gòu)建
        2.3.3 不同配比 hIAPP/Insulin 在五氧化二鉭表面聚集形貌的表征
        2.3.4 hIAPP 在五氧化二鉭表面聚集形貌的表征
        2.3.5 不同比例 Insulin 與 hIAPP 共混對(duì)聚集形貌的影響
        2.3.6 Insulin 在五氧化二鉭二維表面聚集形貌及結(jié)構(gòu)的表征
        2.3.7 hIAPP 與 Insulin 在五氧化二鉭表面共聚吸附動(dòng)力學(xué)表征
    2.4 本章小結(jié)
第3章 磷酸化對(duì)銅離子介導(dǎo) Tau 蛋白 R3 片段產(chǎn)生氧化壓力的影響
    3.1 本章引論
    3.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法
        3.2.1 利用 Fmoc 策略進(jìn)行多肽固相合成方法
        3.2.2 高效液相色譜用于多肽的分離
        3.2.3 BC（浴銅靈）法檢測(cè)一價(jià)銅離子含量
        3.2.4 Ellman 實(shí)驗(yàn)用于自由巰基檢測(cè)
        3.2.5 3-CCA（香豆素-3-羧酸）用于檢測(cè)羥基自由基
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.3.1 R3 與 pR3 多肽的合成與純化
        3.3.2 R3，pR3 肽段能夠還原銅
        3.3.3 R3，pR3 肽段能夠被二價(jià)銅離子催化氧化
        3.3.4 磷酸化可以加速 Cu2+介導(dǎo) R3 羥基自由基的產(chǎn)生
        3.3.5 磷酸化的影響依賴于 pH 環(huán)境條件
    3.4 本章小結(jié)
第4章 定點(diǎn)泛素化修飾蛋白體外合成方法學(xué)的研究
    4.1 本章引論
    4.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法
        4.2.1 MALDI-TOF 質(zhì)譜用于蛋白分子量的檢測(cè)及樣品的制備
        4.4.2 Intein 技術(shù)用于 C 端硫酯蛋白的獲得
        4.2.3 泛素相關(guān)蛋白表達(dá)的常用操作方法
        4.2.4 幾丁質(zhì)親核柱用于蛋白純化實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.5 SDS-PAGE 用于蛋白質(zhì)分子量檢測(cè)及操作方法
        4.2.6 常用試劑和溶液的配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        4.3.1 C-末端修飾為硫脂的泛素單體的合成
        4.3.2 C-末端含乙烯基和巰基活性官能團(tuán)修飾的泛素單體的合成
        4.3.3 Ub-AA 與含巰基小分子的光照偶聯(lián)
        4.3.4 利用 Ub-SH 與含巰基小肽 prp175-195進(jìn)行二硫鍵偶聯(lián)
        4.3.5 含疊氮基非天然氨基酸單體的合成
        4.3.6 K63stop 泛素質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.7 63 位引入非天然氨基酸的泛素蛋白硫酯的合成
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]淀粉樣蛋白聚集的機(jī)理研究和抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與評(píng)價(jià)[D]. 陳媚莎.清華大學(xué) 2012
[2]阿爾茨海默病相關(guān)多肽與Cu～（2+）結(jié)合性質(zhì)的研究[D]. 馬慶豐.清華大學(xué) 2006

碩士論文
[1]阿爾茲海默病相關(guān)蛋白Aβ不同聚集體與銅離子的作用[D]. 房川琳.清華大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3733026