神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）是最為常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,化療是其重要的輔助治療手段,然而耐藥基因的存在是導致化療失敗的重要原因。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是用于治療膠質(zhì)瘤的首選化療藥,易產(chǎn)生耐藥性,O~6-m G DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O~6-m G DNA methyltransferase,MGMT）是TMZ耐藥的主要原因。針對這一問題,本研究建立了化療藥物/靶向耐藥基因共傳遞體系,研究其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制作用。首先利用流式細胞技術篩選了TMZ抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的工作濃度,發(fā)現(xiàn)TMZ對T98G、U251MG、SHG44等均有抑制作用,呈現(xiàn)濃度依賴的方式,且以T98G抑制增殖所需的藥物濃度高,U251MG次之。在上述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中存在內(nèi)源性MGMT表達,以T98G和U251MG表達量較高。隨后,利用RNA干涉技術構(gòu)建了MGMT-sh RNA-284和MGMT-sh RNA-396,在慢病毒載體介導下,MGMT-sh RNA-284具有明顯的沉默內(nèi)源性MGMT作用,能夠提高膠質(zhì)瘤細胞U251MG對TMZ的敏感性。在基因治療策略中病毒載體存在潛在風險,我們聯(lián)合... 

【文章頁數(shù)】：37 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療現(xiàn)狀
    1.2 替莫唑胺是臨床首選的化療藥物，容易產(chǎn)生耐藥
    1.3 MGMT高表達是膠質(zhì)瘤細胞對TMZ耐藥的主要原因
    1.4 陽離子納米載體用于基因傳遞
    1.5 基因和藥物共傳遞系統(tǒng)
    1.6 立題依據(jù)及研究意義
2 材料和方法
    2.1 細胞株、菌種和載體
    2.2 主要試劑
    2.3 實驗儀器
    2.4 細胞復蘇及培養(yǎng)
    2.5 RNA提取及RT-PCR檢測
        2.5.1 細胞總RNA提取
        2.5.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.5.3 RT-PCR
    2.6 動物細胞全蛋白提取
    2.7 SDS-PAGE電泳
    2.8 沉默載體構(gòu)建
        2.8.1 靶點oligo片段的制備
        2.8.2 載體雙酶切
        2.8.3 酶切產(chǎn)物凝膠回收
        2.8.4 連接
        2.8.5 轉(zhuǎn)化
        2.8.6 菌液PCR鑒定
        2.8.7 采用“試劑盒”做大提質(zhì)粒
    2.9 慢病毒包裝
    2.10 細胞增殖檢測方法
    2.11 熒光素酶活性測定
    2.12 建立螢火蟲熒光素酶動物模型
        2.12.1 T98MG-Luc細胞的構(gòu)建
        2.12.2 T98G-Luc裸鼠腦原位瘤模型
3 結(jié)果與分析
    3.1 TMZ有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖
    3.2 內(nèi)源性MGMT在T98G和U251MG細胞中高表達
    3.3 MGMT-shRNA構(gòu)建及其沉默效率檢測
    3.4 MGMT-shRNA增強TMZ對膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用
    3.5 改性的TMZA有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖
    3.6 非病毒載體PEI-PEG有效介導MGMT-shRNA-284 的表達
    3.7 PEI-PEG共傳遞TMZA/MGMT-shRNA抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖
    3.8 原位膠質(zhì)瘤模型建立
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3722049