PINK1（PTEN Induced Putative Kinase 1）是定位于線粒體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,PD（Parkinson’s disease）病人的PINK1基因突變大多導(dǎo)致其激酶活性下降或缺失,因此研究認(rèn)為PINK1的激酶活性對(duì)維持多巴胺能神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)是不可或缺的。線粒體去極化背景下PINK1通過(guò)磷酸化下游底物誘導(dǎo)自噬/線粒體自噬。除了自噬途徑外PINK1在PD發(fā)病過(guò)程中的其他作用機(jī)制或者是聯(lián)合機(jī)制以及具體機(jī)制如何發(fā)揮作用目前還值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因敲除技術(shù)獲得PINK1基因敲除小鼠。取PINK1野生型和缺失型的新生小鼠做原代神經(jīng)元培養(yǎng),用線粒體去極化藥物CCCP分多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（15 min和45 min,2 h和6h）處理做PD模型。然后大規(guī)模檢測(cè)野生型和缺失型小鼠神經(jīng)元細(xì)胞中蛋白質(zhì)及其磷酸化水平變化情況,獲取蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸組學(xué)數(shù)據(jù)后,分析發(fā)現(xiàn)多種激酶信號(hào)發(fā)生改變。我們挑選了一些潛在的靶點(diǎn)展開(kāi)研究。發(fā)現(xiàn)DAPK1與PINK1存在部分共定位且其Ser289和Ser333位點(diǎn)可能依賴于PINK1激酶活性的變化;ULK1的Ser757位點(diǎn)和Ser555位點(diǎn)可能依... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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內(nèi)容摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 帕金森氏病
        1.1.1 PD致病基因PINK1 的功能
    1.2 質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)方法概述
        1.2.1 DDA(數(shù)據(jù)依賴性采集)數(shù)據(jù)采集分析技術(shù)
        1.2.2 DIA(非數(shù)據(jù)依賴性采集)數(shù)據(jù)采集模式
    1.3 ULK1 與自噬
        1.3.1 ULK1 與自噬
    1.4 DAPK1 與細(xì)胞自噬和凋亡
        1.4.1 DAPK1 分子信息
        1.4.2 DAPK1 與自噬和凋亡
    1.5 前期研究進(jìn)展
        1.5.1 蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化組學(xué)結(jié)果顯示PINK1 參與多條細(xì)胞信號(hào)通路
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 常用細(xì)胞
        2.1.4 耗材
        2.1.5 基因克隆引物
        2.1.6 質(zhì)粒
        2.1.7 抗體
        2.1.8 實(shí)驗(yàn)試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 分子克隆
        2.2.2 細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.3 儀器參數(shù)設(shè)置
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 小鼠基因型鑒定及CCCP誘導(dǎo)模型驗(yàn)證
    3.2 磷酸化變化蛋白功能分析
    3.3 磷酸化水平僅在PINK1-WT中上調(diào)的蛋白
    3.4 小規(guī)模驗(yàn)證磷酸化水平上調(diào)的蛋白是否是PINK1 直接底物
    3.5 PINK1與ULK1 以及DAPK1 的相互作用
    3.6 CCCP處理細(xì)胞PINK1 激活后潛在底物磷酸化水平變化情況
        3.6.1 ULK1 磷酸化水平變化與PINK1 有關(guān)聯(lián)
        3.6.2 AMPK磷酸化水平變化隨CCCP處理變化但與PINK1 無(wú)關(guān)
        3.6.3 ERK磷酸化水平變化隨CCCP處理變化但與PINK1 無(wú)關(guān)
    3.7 DAPK1 的磷酸化變化情況影響細(xì)胞自噬和凋亡
第四章 總結(jié)與討論
參考文獻(xiàn)
科研成果
致謝



本文編號(hào)：3715629