目的:本研究通過觀察內(nèi)源性基因RFK表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的兩種形式,對RFK與缺血性腦損傷的關(guān)系進(jìn)行了研究,并對其抑制神經(jīng)元缺血時的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路機(jī)制和通過外源性補(bǔ)充核黃素對RFK基因功能低下的補(bǔ)償作用進(jìn)行了研究。第一部分構(gòu)建RFK慢病毒載體方法:（1）以鼠RFK原始c DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用p Lenti6.3-IRES2-EGFP/V5DEST系列質(zhì)粒載體構(gòu)建包含RFK的過表達(dá)載體,同時以Lenti-EGFP質(zhì)粒載體構(gòu)建成空病毒載體。（2）首先構(gòu)建真核載體pc DNA,選擇3個靶點設(shè)計3組si RNA干擾序列,連接轉(zhuǎn)化鑒定。將制備好的3組si RNA干擾序列載體轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞,提取總RNA及總蛋白。應(yīng)用q PCR和Western Blotting技術(shù)對si RNA干擾前后C6細(xì)胞的RFK表達(dá)進(jìn)行分析,篩選最佳針對RFK基因的si RNA干擾序列。然后以最佳干擾序列的質(zhì)粒載體為模板擴(kuò)增并構(gòu)建到p Lenti6.3-MCS/V5 DEST系列質(zhì)粒載體,構(gòu)建成干擾RFK表達(dá)慢病毒載體。將所得RFK過表達(dá)慢病毒載體、空病毒載體和干擾RFK表達(dá)慢病毒載體感染293T細(xì)胞,檢測病毒滴度。... 

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
abstract
引言
文獻(xiàn)綜述
第一部分 構(gòu)建RFK慢病毒載體
    1 實驗材料
        1.1 實驗動物
        1.2 實驗試劑
        1.3 實驗器材
        1.4 主要試劑配置
    2 實驗方法
        2.1 RFK基因慢病毒載體制備
        2.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng)
        2.3 RFK慢病毒載體轉(zhuǎn)染
        2.4 大鼠MCAO手術(shù)
        2.5 Western blotting
        2.6 統(tǒng)計學(xué)方法
    3 實驗結(jié)果
        3.1 RFK基因過表達(dá)慢病毒載體制備
        3.2 干擾RFK基因表達(dá)慢病毒載體制備
        3.3 滴度計算
    4 討論
第二部分 RFK抗缺血性腦損傷的作用機(jī)制
    1 實驗材料
        1.1 實驗動物
        1.2 實驗試劑
        1.3 實驗器材
        1.4 主要試劑配置
    2 實驗方法
        2.1 腦水腫測定
        2.2 RFK表達(dá)上調(diào)對腦梗死面積的影響
        2.3 制備OGD模型
        2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.5 神經(jīng)元細(xì)胞活力檢測
        2.6 流式細(xì)胞儀檢測凋亡
        2.7 增加攝入核黃素對RFK基因功能低下的補(bǔ)償作用
        2.8 其它操作方法
        2.9 統(tǒng)計學(xué)方法
    3 結(jié)果
        3.1 核黃素抑制MCAO后大鼠腦水腫
        3.2 RFK表達(dá)上調(diào)抑制MCAO后大鼠腦梗死面積
        3.3 RFK表達(dá)上調(diào)與下調(diào)對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響
        3.4 RFK表達(dá)上調(diào)及下調(diào)對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響
        3.5 RFK表達(dá)上調(diào)及下調(diào)對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響
        3.6 RFK 表達(dá)上調(diào)及下調(diào)對內(nèi)激網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響
        3.7 加入 Erodoxin,RFK 表達(dá)上調(diào)對神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響
        3.8 增加攝入核黃素對RFK基因功能低下的補(bǔ)償作用
        3.9 去除核黃素對 RFK 表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的神經(jīng)元細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡的影響
        3.10 補(bǔ)充核黃素、FMN,FAD,RFK 表達(dá)下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞活性、凋亡結(jié)果
    4 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
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本文編號：3705490